【求助】 目的蛋白位置变化

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• tie8 (2014-2-07 16:06:12)

  蛋白质二聚体?

• huifeng0516 (2014-2-07 16:06:31)

  
  我也遇到同样的问题，我的目的蛋白116KD,但做了几次均在70KD左右出现比较清晰的条带，背景很干净，没有其他的杂带，也正苦闷着呢，至今仍没找到原因！应该不是二聚体的问题，因为在上样前蛋白都要煮沸变性的！我最初怀疑是蛋白降解所致，但好像也说不通，你的这种情况就不能这样解释。希望哪位老师给予指导！谢谢！

• bring (2014-2-07 16:06:54)

  
  我的情况也大致相同.
  我的目的蛋白是33KD,但是做了几次,用考马斯R250染色都是在70-85KD之间有清晰条带,而且很浓,当然30KD附近也有条带,相对较淡.Western blot后胶片上还是在 70-85KD附近有明显的暴光后条带.反而30KD附近没有条带.我只加了一种特异性抗体.
  如果真的是蛋白二聚体,有没有办法打开?
  很奇怪也无法解释,请有经验的人进来讨论啊!

• windy+++ (2014-2-07 16:07:17)

  
  目的条带变大有可能是糖基化的结果，我做的很多蛋白都比预测的要大些。
  如果是比预期的小，那请问你的一抗是单抗还是多抗，如果是多抗，那基本是杂带。

• ha111 (2014-2-07 16:07:35)

  
  出现以上情况，可以从以下几方面来考虑：
  1 COX-2的大小为70-72kD，是否为根据蛋白质的氨基酸序列计算出的分子量，这个分子量和蛋白质电泳的分子量很多时候不一致。道理很简单，蛋白质往往要经过翻译后修饰，如糖基化、磷酸化、甲基化等，这样蛋白质才能成为有活性的蛋白，这些修饰都会使蛋白质的分子量增加。
  2 如果电泳时的表观分子量少于蛋白质的计算分子量，可能是蛋白质亚基之间的二硫键被还原，亚基被解离，SDS-PAGE测定出蛋白质亚基的分子量，这个分子量显然要小于蛋白质的分子量。
  3 不排除杂带的影响。

• bring (2014-2-07 16:28:03)

  出现以上情况，可以从以下几方面来考虑：
  1 COX-2的大小为70-72kD，是否为根据蛋白质的氨基酸序列计算出的分子量，这个分子量和蛋白质电泳的分子量很多时候不一致。道理很简单，蛋白质往往要经过翻译后修饰，如糖基化、磷酸化、甲基化等，这样蛋白质才能成为有活性的蛋白，这些修饰都会使蛋白质的分子量增加。
  2 如果电泳时的表观分子量少于蛋白质的计算分子量，可能是蛋白质亚基之间的二硫键被还原，亚基被解离，SDS-PAGE测定出蛋白质亚基的分子量，这个分子量显然要小于蛋白质的分子量。
  3 不排除杂带的影响。
  
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  请问，如果目的蛋白被糖基化，或者其它原因引起了分子量变大，那还能确定它是否是目的蛋白。我的抗体是单抗。
  如何能解决这个问题？
  谢谢！急待！

• redbutterfly (2014-2-07 16:29:01)

  单抗的特异性很高，应该可以确定。建议你去查下别人做COX-2电泳的文献，如果文献报道的分子量也在110-130kD之间，那就可以肯定是这个蛋白了。

• 逗号是句号 (2014-2-07 16:29:21)

  
  我一般在做一个新的蛋白的内源表达之前，都上abcam之间的网站查一下相应的抗体说明，一般都会配有这个蛋白抗体做表源表达的图，并且会标明蛋白的理论MW和实际MW

• bring (2014-2-07 16:29:41)

  
  谢谢楼上两位！
  我先去查查看，另外我也找过有经验的老师问过，他们说如果上样前添加的loading buffer 时间过长里面的巯基乙醇会挥发，也会影像二硫键的打开。所以今天重做一下，看看有没有影响。
  另外我也问过，即使是被糖基化、磷酸化、甲基化等作用分子量会增加，但是也不会增加很多，更不是双倍。所以有相似经历的战友们，还是多找找原因，大家讨论一下会有更多收获。
  希望咱们都能有不错结果！

• bring (2014-2-07 16:29:58)

  出现以上情况，可以从以下几方面来考虑：
  1 COX-2的大小为70-72kD，是否为根据蛋白质的氨基酸序列计算出的分子量，这个分子量和蛋白质电泳的分子量很多时候不一致。道理很简单，蛋白质往往要经过翻译后修饰，如糖基化、磷酸化、甲基化等，这样蛋白质才能成为有活性的蛋白，这些修饰都会使蛋白质的分子量增加。
  2 如果电泳时的表观分子量少于蛋白质的计算分子量，可能是蛋白质亚基之间的二硫键被还原，亚基被解离，SDS-PAGE测定出蛋白质亚基的分子量，这个分子量显然要小于蛋白质的分子量。
  3 不排除杂带的影响。
  
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  请教一下，如果想知道蛋白质到底是怎么被修饰，如何鉴定？

• mysmdbl (2014-2-07 16:30:24)

  最近做其它两个蛋白，仍然遇到类似的问题。我用的是santa的多抗，都是在比预期位置大很多，有时甚至接近2倍的地方出现非常深的条带。曾怀疑是样品没处理好，二硫键没有打开，但用同样的样品做其它目的蛋白位置就是正常的。如果确实是蛋白受到了某些修饰，那么该蛋白是否可以代表未修饰的蛋白？

• mysmdbl (2014-2-07 16:31:56)

  cox-2的大小是抗体说明书上给出的。有文献上说cox-2在组织中以同源二聚体形式存在，那么是否可认为我检测到的是其二聚体，且可以代表组织中COX-2的表达情况？看过很多做了cox-2蛋白表达的文献，只给出了结果，没标出蛋白的大小

• mysmdbl (2014-2-07 16:32:55)

  谢谢你的建议，我会去abcam的网站查查
  希望遇到类似情况的战友继续讨论，找出问题的真正原因。

• ha111 (2014-2-07 16:38:09)

  看到这个帖子 立马进来了解一下情况
  我做WB也出现了同样的 问题
  我是检测NF-kB P65
  但是连续做了四次 对照了一下marker（fermenta公司的 货号0671
  都是在50kd位置
  也一直纳闷中 不知道到底怎么回事
  真是希望哪位老师 解决一下这个问题

• fei1226com (2014-2-07 16:39:10)

  这个帖子很好,我也一样,做了几个月,一直都是高于自己的位置出现了,而且很漂亮,不知道是什么原因呀................
  大家一起来讨论,当然更重要的是高手来讨论了
  并解释原因

• hold住 (2014-2-07 16:42:29)

  
  是呀，我做出来的分子量，也偏大，为什么呢？？

• gemei0115 (2014-2-07 16:42:54)

  请问，如果目的蛋白被糖基化，或者其它原因引起了分子量变大，那还能确定它是否是目的蛋白。我的抗体是单抗。
  如何能解决这个问题？
  谢谢！急待！
  
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  我想，你可以试试去糖，看看结果如何？

• bring (2014-2-07 16:43:17)

  请问各位如果是用WB做的，想把SDS胶拿去用质谱检测，有没有具体方法？

• bring (2014-2-07 16:43:37)

  
  另外跟大家讨论一下，我的目的蛋白的确是容易形成二聚体。但是我用10%巯基乙醇放置一夜后，第二天再做SDS电泳，结果是再25kd附近多了好多的条带，是以前没有的。但是70kd附近的浓条带依然存在。、
  不但没把上面的二聚体分开，还把下面小分子的分的更小了，真不知道有什么办法了。
  我电话去买抗体的SANTA公司，他们建议我做质谱鉴定。请问怎么做，有谁可以赐教！谢谢！