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【求助】信号通路蛋白western问题
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发表于: 2014-2-07 17:25 作者: 30moonriver 来源: 分析测试百科网
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【求助】信号通路蛋白western问题
同一张膜结合过ERK一抗后能用洗脱后再结合p-ERK,p-38,jnk等抗体吗?蛋白上样20ug够吗?
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【求助】信号通路蛋白western问题
我也来说两句
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最新回复
c86v
(2014-2-07 17:26:40)
可以,但是效果稍微差些。
20ug少了一点,30-50ug吧。
abc816
(2014-2-07 17:27:11)
20ug有点少。同一张膜可以发不同的抗体,但个人觉得做的次数越多,条带会的越变弱,尤其是含量少的蛋白。我一般做的时候先发含量少的蛋白,再发含量多的,最后发内参,但一张膜最多只用4次。
30moonriver
(2014-2-07 17:27:28)
请问洗脱方法怎样?是否要买特定的膜洗脱液?
hot_hot_hot
(2014-2-07 17:28:18)
抗体洗脱液我是自己配的,甘氨酸 1.875g,SDS 10g,浓盐酸2.5ml,加水1000ml。
yes4
(2014-2-07 17:28:47)
我和楼主做的同样的蛋白,也尝试过用洗脱液,结果洗脱后连内参的条带也变得很弱了。做了多次试验,总蛋白ERK,JNK条带很好,但磷酸化一直有很多杂带,目的条带不很清楚,郁闷中。另外请教楼主一个问题,P38的分子量是多少啊?我的说明书上写的43KD,但一位专家级的人物说应该是38KD,而且我也在小于43KD的位置做出了比较清楚的条带,但却不敢确定是否是目的条带。
vvmmoy
(2014-2-07 17:31:01)
不行吧,erk和p-erk的目的蛋白在一个分子量上,而且还是两条带,这样做会相互重叠很难分清结果谁是谁非啦。
我们一般是把分子量有一定差距的抗体在一张膜上做,不用洗脱液,只需要分两次孵育抗体就可以了,第一次发光后,直接孵上第二种抗体,过夜,第二天再发光。
分子量一样的抗体,或者相离很近的抗体,不建议用这种方法,会混淆结果的。
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c86v (2014-2-07 17:26:40)
可以,但是效果稍微差些。
20ug少了一点,30-50ug吧。
abc816 (2014-2-07 17:27:11)
30moonriver (2014-2-07 17:27:28)
请问洗脱方法怎样?是否要买特定的膜洗脱液?
hot_hot_hot (2014-2-07 17:28:18)
抗体洗脱液我是自己配的,甘氨酸 1.875g,SDS 10g,浓盐酸2.5ml,加水1000ml。
yes4 (2014-2-07 17:28:47)
我和楼主做的同样的蛋白,也尝试过用洗脱液,结果洗脱后连内参的条带也变得很弱了。做了多次试验,总蛋白ERK,JNK条带很好,但磷酸化一直有很多杂带,目的条带不很清楚,郁闷中。另外请教楼主一个问题,P38的分子量是多少啊?我的说明书上写的43KD,但一位专家级的人物说应该是38KD,而且我也在小于43KD的位置做出了比较清楚的条带,但却不敢确定是否是目的条带。
vvmmoy (2014-2-07 17:31:01)
我们一般是把分子量有一定差距的抗体在一张膜上做,不用洗脱液,只需要分两次孵育抗体就可以了,第一次发光后,直接孵上第二种抗体,过夜,第二天再发光。
分子量一样的抗体,或者相离很近的抗体,不建议用这种方法,会混淆结果的。
【求助】信号通路蛋白western问题