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【求助】镍柱堵塞后再生
各位前辈好，本人是一名纯化新手。使用的是novagen公司的镍纯化柱，新的，效果很好，但是不幸的是，在第三次纯化蛋白时出现了轻微的柱体堵塞（怀疑是离心不彻底），用3mol NaCL,和2mol NaOH,洗柱子，后用去离子水冲洗，效果很好，很干净，然后保存在20%的无水乙醇中过夜，但是下次纯化蛋白发现，不挂蛋白了（都在滤液里，纯化后只有第三管有少许）请问有什么方法补救，谢谢。【求助】镍柱堵塞后再生
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最新回复
avi317 (2014-2-08 11:01:53)
yapuyapu (2014-2-08 11:02:55)
utt0989 (2014-2-08 11:03:28)
tie8 (2014-2-08 11:03:49)
1、2倍再生水（6M盐酸胍，0.2M醋酸）
2、5倍水
3、3倍2% SDS
4、1倍25%乙醇
5、1倍50%乙醇
6、1倍75%乙醇
7、1倍100%乙醇
8、1倍75%乙醇
9、1倍50%乙醇
10、1倍25%乙醇
11、1倍水
12、5倍100mM EDTA.PH8.0
13、10倍水
14、2倍100mM NiSO4Rechage
15、2倍水冲洗
16、2倍再生Buffer冲洗
17、2倍适宜的Buffer平衡（BufferNPI-10，BufferB）
6327555 (2014-2-08 11:04:08)
谢谢，柱子能用了，但是流速比以前慢点，而且效果略微没以前好。
langlang (2014-2-08 11:04:51)
不好意思，问一下，Ni柱应该不能用SDS处理吧？？
据说是因为SDS是强阴离子去污剂，会与镍柱上一的一些集团发生强结合很难去除。
一般建议用8M尿素处理，或是按照填料说明书进行在处理。
langlang (2014-2-08 11:17:52)
补充一下，
一般亲和层析的填料可以反复使用N次的。目前我也在做亲和层析，使用的是GE公司的IMAC填料，样品为大肠杆菌破碎上清。如果想要提高填料的使用寿命可能需要注意以下几点（针对可溶性表达哈）：
1.样品的预处理：离心后取上清，然后对上清进一步做澄清处理，我一般用预过滤滤芯对样品进行澄清（国产的滤芯也可以而且成本不高，几十元就可以搞定），可以出去一些颗粒并降低粘度，效果不错。也可以用硫酸铵沉淀。
2.柱床体积要适度：一般上样量为30～50%CV均可。
3.及时再生Ni2+：因为本来上清溶液中的成份就比较杂，会存在较多的非特异性结合蛋白、色素什么的，所以一般我洗脱目的蛋白后就会用1M咪唑洗去一部分杂蛋白，然后用0.1MEDTA洗去Ni2+，然后用水冲洗，再用20%乙醇保存备用。
4.柱清洗：使用数次感觉柱压变大，或柱床看起来较脏时，建议对柱床进行彻底清洗，以防层析效果不理想。一般用1M NaOH浸泡1h作用，然后1MNaCL至中性，再用蒸馏水洗柱后上Ni2+；或者1MNaOH+1MNaCL充分过柱后浸泡1h，然后1MNaCL至中性，再用蒸馏水洗柱后上Ni2+。最后用蒸馏水去未结合Ni2+，接着用含有咪唑或相应洗脱元素的缓冲液饱和一下柱床，有助于降低非特异性蛋白的结合。效果还是不错的。
经过这样的处理后我的柱料一般可以反复使用20次。不过也要根据不同蛋白和表达体系的特异性 ，我的蛋白比较特别，如果换其他种蛋白可以使用的次数应该会更多。
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