【求助】his蛋白纯化，杂蛋白

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• NBA (2014-2-08 11:22:08)

  
  信息不足不好分析，两个泳道分别是什么？哪个是目的条带？
  不过总的来看不过是哪个效果还差得很远，his纯化应该能达到很高的纯度才对
  祝好运！

• junjie05 (2014-2-08 11:22:35)

  QUOTE:

  原帖由 NBA 于 2014-2-8 11:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  信息不足不好分析，两个泳道分别是什么？哪个是目的条带？
  不过总的来看不过是哪个效果还差得很远，his纯化应该能达到很高的纯度才对
  祝好运！ ...

  我的判断以泳道左边为Marker，右边为您纯化的蛋白。
  您的目的蛋白上方杂带不多，而下方有好几条粗带，不可能为非特异性吸附，那就是蛋白降解条带，带有His标签，这个是最大的可能性。
  解决方案：
  1.缩短IPTG诱导时间；
  2.从破碎开始就低温操作；
  3.纯化过程中添加PMSF；
  个人觉得您的蛋白不是很稳定，也不知您蛋白是否是融合表达，您提供的信息太少，祝好运！

• lagua123 (2014-2-08 11:22:57)

  
  杂蛋白的原因很多，杂蛋白与柱的非特异结合，杂蛋白与目的蛋白的结合。
  这个似乎是不同程度的降解，做个WB看看。如果是的话，上个MonoQ。
  也可以按楼上的做法，不过个人认为效果不是很大。

• TAT (2014-2-08 11:23:15)

  
  尝试在过ni柱的时候逐渐降低pH，有可能除掉杂蛋白。
  下面的那个粗带，可能与你的蛋白结合的很紧，所以很难除掉，如果是这样那就难了。
  我曾经就遇到过这个问题，晕的不行，那个杂蛋白怎么都除不掉，尝试了几乎所有的柱子，还是不行。

• kulee (2014-2-08 11:23:44)

  QUOTE:

  原帖由 NBA 于 2014-2-8 11:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  信息不足不好分析，两个泳道分别是什么？哪个是目的条带？
  不过总的来看不过是哪个效果还差得很远，his纯化应该能达到很高的纯度才对
  祝好运！ ...

  我这个是纯化得很好的效果的啦！还有几次实验更差，不过我没孔的上样量只有5ul.

• kulee (2014-2-08 11:24:10)

  QUOTE:

  原帖由 TAT 于 2014-2-8 11:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  尝试在过ni柱的时候逐渐降低pH，有可能除掉杂蛋白。
  下面的那个粗带，可能与你的蛋白结合的很紧，所以很难除掉，如果是这样那就难了。
  我曾经就遇到过这个问题，晕的不行，那个杂蛋白怎么都除不掉，尝试了几乎所有的柱子，还是不行 ...

  我目前用的缓冲液PH为7.9，目的蛋白的理论PI值是7.6，请问依您的意见，降低PH是从什么梯度为适呢？谢谢

• kulee (2014-2-08 11:24:29)

  QUOTE:

  原帖由 junjie05 于 2014-2-8 11:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  
  我的判断以泳道左边为Marker，右边为您纯化的蛋白。
  您的目的蛋白上方杂带不多，而下方有好几条粗带，不可能为非特异性吸附，那就是蛋白降解条带，带有His标签，这个是最大的可能性。
  解决方案：
  1.缩短IPTG诱导时间；
  2.从破碎开 ...

  谢谢您的解答！
  我做的是His标签融合蛋白的纯化，纯化后的蛋白尚需通过酶切去除his标签。
  IPTG(0.01mM)在20℃诱导16h。低温操作虽然不是随时都注意啦，但也能做到的时候尽量低温。PMSF是在超声破碎前加的。
  不知道还有什么是我没有提供的信息。
  另外：我还想请问一下目的片断上方的杂蛋白是否需要去除？该如何去除呢？

• kulee (2014-2-08 11:24:49)

  QUOTE:

  原帖由 lagua123 于 2014-2-8 11:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  杂蛋白的原因很多，杂蛋白与柱的非特异结合，杂蛋白与目的蛋白的结合。
  这个似乎是不同程度的降解，做个WB看看。如果是的话，上个MonoQ。
  也可以按楼上的做法，不过个人认为效果不是很大。 ...

  谢谢您的解答！
  我想请问下MonoQ能解决我这个问题吗？
  我目前用的柱子是默克的预装柱，按试剂商的说法是结合的特意性应该是很好的。但是我已经做了好几次，每次都是在120mM咪唑浓度的时候随杂蛋白一道被洗脱。不仅仅是下方的，上方也有不少。图片中右边泳道的蛋白上样量只有5ul，如果加大浓度的话，那么上方的杂蛋白也会很明显的。
  我想请教一下：如果下方的考虑为目的蛋白的降解产物的话，那么上方的呢？该如何去除呢！？
  谢谢

• bs4665 (2014-2-08 11:25:05)

  
  不应该把下方的条带判断成降解产物，至少要通过实验来判断吧（做一个37度水浴时间长短对照，如果是降解，时间越长杂带越多）
  咪唑洗脱时，最好 50mM 一个梯度，每个浓度梯度 用 manual 推荐的体积洗脱，或者 2倍柱体积。

• vcve (2014-2-08 11:25:24)

  再加几个咪唑洗涤梯度，如50mM，100mM，150mM
  另外在破菌缓冲液里面也可以加入咪唑，0-40mM，这个得自己摸索
  还可以在破菌缓冲液里面加0.5M盐酸胍，可以破坏蛋白二聚体的形成（破坏蛋白之间的相互作用），同时对蛋白活性没有影响，当然对Ni柱纯化也没有影响
  你说的PI为7.6，是你测出来的吗，还是用软件预测的。如果是软件预测的话，一般都不准的。
  我所说的逐渐降低pH，是指你可以用个梯度混合仪，用两个不同的pH，这样形成一个介于两个pH之间的梯度洗脱体系。如果觉得麻烦，那你下次就直接用pH7.0的缓冲液挂Ni柱，看看效果怎么样。

• kulee (2014-2-08 11:26:05)

  谢谢您的解答！
  我做的是His标签融合蛋白的纯化，纯化后的蛋白尚需通过酶切去除his标签。
  IPTG(0.01mM)在20℃诱导16h。低温操作虽然不是随时都注意啦，但也能做到的时候尽量低温。PMSF是在超声破碎前加的。
  不知道还有什么是我没有提供的信息。
  另外：我还想请问一下目的片断上方的杂蛋白是否需要去除？该如何去除呢？
  
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  既然还要酶切，就不用管了，切了标签再上Nickel column，看看结果如何。
  如果不是降解片段，应该全部结合在柱子上。

• kulee (2014-2-08 11:26:28)

  
  汇报：我调整了实验方案，超声碎菌后立即进行过柱纯化，目的蛋白下面的条带明显减少！