【求助】WB出现问题，请大家帮忙

最新回复

• nn255 (2014-2-08 12:47:10)

  QUOTE:

  原帖由 气泡 于 2014-2-8 12:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  我们整个实验室在跑胶时染胶后都出现了一个问题就是只在胶的上面三分之一有条带，下面什么都没有，现在老师也在分析几种原因：
  1。考马斯亮兰？ 但是这里出问题应该不大，因为如果不行哪就会染不上？
  2。胶不行，哪几种成分，到底哪 ...

  你这上面的胶组成里怎么没有丙烯酰胺？这个成分保证肯定好用?

• mimili_901 (2014-2-08 12:47:26)

  加上个彩虹marker跑一下，看看marker是否能跑下来。

• 气泡 (2014-2-08 12:47:51)

  
  哦,不好意思.我忘记了,有丙烯酰胺的,我们用的30%的,
  至于彩色的marker我们一直都是这样用的呀,可以跑下来的,我也正在想,如果marker都可以的话,哪到底出在哪里呢?
  现在我们重新配了以下几种东西:
  丙烯酰胺(30%)
  tris-hcl（分别有1.5M和1.0M的,PH分别是8.8和6.8)
  SDS(10%)
  先从这几个去试试!!
  我对楼上的还是比较感兴趣的,因为彩色marker可以下来,为什么蛋白质下不来,还是真的我们整个实验室的提取体系出问题了???????????
  再谢谢大家,能不能帮我想想?您们有没有碰到过这样的情况?
  谢谢!!!

• qqq111 (2014-2-08 12:48:08)

  
  SDS的质量很重要,最好用进口的.SDS质量不好会导致小分子量蛋白质条带弥散.

• 气泡 (2014-2-08 12:48:30)

  
  可是我们一直以来都是用自己配的直接拿来提取蛋白，然后不用离心，直接上样，。。。。。。。。。也不知道是什么原因。。。。。。原来不会呀。

• qqq111 (2014-2-08 12:48:58)

  我是指配PAGE胶的SDS

• fsdd817 (2014-2-08 12:49:35)

  是不是跑电泳中间短路了？

• 气泡 (2014-2-08 12:50:03)

  
  怎么短路呀？
  我们的SDS肯定是进口的，以前一直都用的，都没有问题的，就是最近出现了这个问题，不知道是什么原因。。。。。。。。。。。。。。。

• 131415 (2014-2-08 12:50:21)

  
  TRIS的PH有问题。
  呵呵，重配，让后调好ph。
  就OK !

• dongdongqiang (2014-2-08 12:50:58)

  
  彩色的marker能跑开吗？彩色的marker跑得没问题的话，胶就没问题。应该是样品的原因，你的提取方法不用离心，就是不去除DNA的，可能有干扰。用RIPA裂解液试试。

• okhaha (2014-2-08 12:51:14)

  应该是样本的问题

• 气泡 (2014-2-08 12:51:43)

  如果是样品有问题的话，我用RIPA体系的话可能不能用考马斯亮兰测浓度呀，
  现在连marker也出现问题了,只是上面几个高分子量的可以跑开,下面的也跑不开了,难道是电源或电泳仪的问题?
  哪如果是,问题又出在哪里呢?
  谢谢大家!

• 气泡 (2014-2-08 12:52:04)

  
  PH上次全部换新的，还是不行呀，连marker都跑不下来了,真是烦呀,如果电源或者电泳仪坏了的话觉得问题在哪呀?

• youyou99 (2014-2-08 12:52:20)

  
  TRIS的PH是准的话，是不是跑电泳室温很低？室温很低对电泳体系有影响。RIPA要用BCA法或lowry法测浓度。

• 气泡 (2014-2-08 12:52:38)

  这几天一直在试，感觉现在还是不行呀，现在marker可以下来,但是跑得好慢,以前100V恒压到底只要50分钟,现在120V都要好久了,至少一个半小时,这样就来可能就是能跑但是跑得好慢,电流只有17左右,高手有没有碰到这种情况......................

• 气泡 (2014-2-08 12:53:08)

  这么好的话题呀,现在我们一直在摸.,到时发现在哪有问题也好说呀,如果到时发现了我会发上来的...........

• hold住 (2014-2-08 12:53:38)

  这几天一直在试，感觉现在还是不行呀，现在marker可以下来,但是跑得好慢,以前100V恒压到底只要50分钟,现在120V都要好久了,至少一个半小时,这样就来可能就是能跑但是跑得好慢,电流只有17左右,高手有没有碰到这种情况......................
  
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  你们怎么跑的时间这么短呀？我们实验一般在上层胶70V跑半个小时，下层10%分离胶120V跑一个半小时，这样胶才能跑开。
  我曾经用15%分离胶，跑了近三个小时也没跑开，几乎都集在上部分了。
  所以我建议你们是不是时间跑长点，另外如果丙稀酰胺是自己配的，重配一下，看看是不是可以？因为我觉得如果丙稀酰胺时间长了，浓度会比实际的高了，而用你们电泳时间根本就下不去。此外，我们的电泳仪的电流也非常不正常，一般是刚开始显示还有点，十几已经算是很大的了，常常是跑到后面都变负的了，但似乎不影响跑胶，所以一直这么用着。
  仅供参考。

• 气泡 (2014-2-08 12:54:11)

  
  恩，谢谢回复，我今天又跑了，并取二个泳道来染胶，转膜后也用丽春红染，
  今天先用60V跑1个小时，然后用110V跑2个小时，总觉得marker拉不开,我们的胶的是12%的
  最后结果胶看上去没有什么东西,以前用同样的方法提取的跑胶都有好多明显的条带,现在感觉什么都没有,膜也丽春红染也是什么条带都看不到,说蛋白分解也不大可能呀,是昨天提的呀,今天就用,而且我一同学和我同时跑,每人一块胶,我看到她的胶上也看不到条带,这到底是怎么回事呀?原来都可以看到的..............现在却,而且测蛋白浓度当时也不低呀,6微克每微升左右,一电泳却什么都看不到了??????????
  总觉得近时间怪事特别的多,都不想做下去了,哎
  以前师兄师姐一直都可以用2*SDS提取蛋白,现在我们一用却不行..................前时间都可以用的,可以看到条带的,现在却什么都没有...........................请大家多帮忙呀....................现在吐血不止,五内俱焚啊....................................大家都不明白到底是怎么样了..............................................
  

• xingyi08 (2014-2-08 12:54:40)

  建议电泳完了不转膜，直接染块胶看看
  另外，电泳液也有很大的影响，最多用两次，你用的什么配方？
  换电压的时间，我的办法是在分离胶和浓缩胶的分界面用记号笔在玻板上画条线，看到样品进入分离胶后再换电压。我也是跑12的胶，用的电压是80V，120V。

• 气泡 (2014-2-08 12:54:57)

  
  染胶也是什么都没有，只有纵带，没有一条条横带，前时间做的都有的，不知道怎么了，感觉只是原来是师姐他们配的2*SDS，现在是自己配的，还有就是现在用得比较多了，原来用得少，比如一瓶细胞原来加60微升，现在加到100甚至更多，还有就是现在配方由原来的B巯基乙醇换为DTT了,但听说这个没有影响呀,因为后者和前者的作用是一样的,而且无毒,其实没有变,最可能的是他们原来的东西没有变坏,现在东西变坏了,谢谢大家!!!