【求助】转膜怎么也转不上,怎么办啊？

最新回复

• Ao7 (2014-2-08 16:30:47)

  
  我上次也是转不上膜，最后发觉是自己甲醇过期了，1，你仔细再检查下自己配的试剂。2，我认为你应该提高转膜电流至少达到250mA 1.5h自己多摸索吧。你提出来的蛋白浓度是多大？做的什么组织？

• H2O (2014-2-08 16:31:06)

  减少转膜的时间 改成100v 75min 再试试
  还有 一定要赶走滤纸、胶、 膜 之间的气泡。
  要有信心 相信自己 实验才会成功
  祝好运！

• 雪花子 (2014-2-08 16:31:46)

  你好,感谢你的关注.
  我做的是果蝇幼虫, 蛋白上样量是125ug/孔, 蛋白跑出来带好好的也很清晰, 就是转膜转不上, 今天做我还特意新开了一瓶甲醇,但也还是没有.转膜Buffer是现用现配的.

• 雪花子 (2014-2-08 16:34:14)

  是不是就算转过了也应该有部分条带啊?我的胶上还有一些大分子量的没有转出来.
  

• zsxan1990 (2014-2-08 16:34:59)

  你怎么知道是转膜的原因呢？根据你的描述，我认为不像是转膜的原因。
  分子量小的蛋白在胶上已经不见了，说明转过去了，转膜是成功的，分子量大的蛋白有残留也是很正常的。丽春红染色不是任何时候都能看见带的，尤其蛋白量少或条带有点弥散的时候，丽春红的分辨率怎么能和western比呢？丽春红看不见带就往转膜身上找原因是完全错误的。
  你可以看看刚刚转完后的膜，是否上面有一条一条的蛋白印迹，如果有，你就考虑转膜以外的其他原因吧。

• sunnyB (2014-2-08 16:35:48)

  转膜前,膜在甲醇中浸泡2min, ddH2O中5min, 转移Buffer中浸泡10min,但我发现膜老是容易在上面漂着.上下两层滤纸(普通的),用前也浸泡在转移Buffer中10min.
  ,但膜用丽春红染色却什么也没有.
  
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  个人认为：
  1. 膜老是飘着，这就是问题。你可以甲醇浸泡后，放到转移buffer中浸泡的时间长一些。注意换一瓶甲醇，浸泡后把膜用小镊子浸到buffer里面。我们的膜没有飘在上面的。
  2.立春红没带，应该就是没有转印上去吧。可能因为膜活化的不好，蛋白没有到膜上，而可能是到了转印buffer里了。

• yonger (2014-2-08 16:37:50)

  
  有可能是电压太高，你用稳流转一下试试，300mA

• 雪花子 (2014-2-08 16:39:36)

  
  谢谢大家
  版主说的转完后的膜，是否上面有一条一条的蛋白印迹，这我到没注意,但昨天我把膜继续用来作杂交了,最后仍然什么也没有,膜上有一点背景显色了,但很明显不是带, 是随机分布的
  我按大家的意见再做几次试试看

• ritou1985 (2014-2-08 16:40:04)

  
  
  相关疾病：
  水疱
  我也遇到过这样的问题，一般转膜我们用恒流200mA，2小时 这可以根据分子量和试验情况调整，关键是用甲醇激活后置于转移缓冲液内应多泡一会儿，一般半小时吧，膜在缓冲液飘着很正常，说明没有泡透，延长时间看看。另外，为什么用水泡5分钟呢？试着省略这一步看看。多

• xingyi08 (2014-2-08 16:40:43)

  
  我有点怀疑是不是有的转过了？按道理胶上的蛋白都没了说明转移很有效。你的预染marker应该能提供有用的信息啊，不会是电极插错了吧？我有一次犯过这样的错误，结果预染marker都看不见，无论胶上，膜上，抑或是滤纸上。你可以转15min就拆开看一眼预染marker的情况，总能找到原因的，祝好运！

• mamamiya (2014-2-08 16:43:31)

  
  你们都是湿转吧，我用半干恒流转，0.8mA/平方厘米，转1小时，有时膜上能看见条带，有时没条带，最近遇到个新问题，转完后胶缩小约3-4mm，膜上立春红染色没条带。不知道为啥

• she (2014-2-08 16:43:52)

  
  如果你是用的pvdf膜，你可以在立春红染后用甲醇清洗，这样可以很快将膜洗干净。无法看到条带很可能是你在立春红里染的太久了，用水脱色要脱很久。
  你的上样量很大，但不代表你的目的蛋白量也大。
  还有就是你的转膜buffer，分子克隆上的配方是：2.9g 甘氨酸，5.8gTris, 0.37g
  SDS, 200ml甲醇，加水到1000ml。sds是一定要加的，不加的话条带肯定会转散。
  建议你在点样的时候加上预染marker，可以帮助你大致判断转移的情况。
  你的转移条件我不好说，机器功率不一样。
  最后祝你成功。

• tuuu2 (2014-2-08 16:44:14)

  为什么33kd的检测的结果也有条带，不知道为什么不明显

• 了了 (2014-2-08 16:44:32)

  
  你说转膜前膜先在甲醇中泡2min？
  我也用pvdf膜半干转，在甲醇中只活化15s的，然后在水中泡10min，最后在转膜液中泡15min（4度）才转的。
  是不是你泡甲醇的时间太长了？

• xue258 (2014-2-08 16:44:51)

  
  我是PVDF膜的湿转，甲醇中活化10-15s，然后直接浸泡于转移缓冲液中。
  记得以前在那本书上看过，说PVDF膜在甲醇中活化时间不能超过15s。不过我不清楚具体原因。
  楼上的能说明一下用水浸泡的原因么？