【求助】western blot条带为什么时有时无

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• birdfish (2014-2-08 17:25:15)

  
  转移效率怎么样？转膜后可以用丽春红S染液染膜，看看目的蛋白位置有没有条带。
  大分子量蛋白的转膜缓冲液可以少加些甲醇甚至不加，加些SDS（0.375－1％），有利于大分子转膜（高含量甲醇利于小分子转膜）。可以试试低电压过夜转（50v或者60v，），转移效率可能好些。
  试试加大一抗浓度（可能会导致非特异条带增加）。或者做个斑点印迹（不用电泳和转膜，直接把蛋白样品点在膜上），找出比较合适的一抗和二抗浓度，也能试出比较合适的上样量。

• u234 (2014-2-08 17:25:43)

  
  做WB重要的是摸条件 条件摸好了 结果就容易出来了
  结果出不来的时候 别着急 一步一步找原因
  首先你跑完电泳了 可以用考马染个胶看看 以证明你提的蛋白没有问题
  然后转完摸后 用立春红染色 以证明蛋白是否从胶上成功转到摸上了
  如果这些没有问题 那以后电泳 转摸的条件就不要变了
  摸摸一抗 二抗的浓度 首先还是从抗体的做小稀释比做 即从大浓度开始做
  尽管会出现非特异性条带 最起码条带出来了 然后再已不同的抗体稀释比做
  背景深了 可以加大封闭液的浓度和时间
  总之 试验是慢慢总结出来的 祝楼主试验顺利！！

• remonte (2014-2-08 17:26:14)

  蛋白提取是好的，同样的蛋白做95kd的目的条带可以做出来，丽春红也染的，但是大条待的地方普遍比较淡，考马斯试剂没有，所以还没染过胶，浓度梯度做过，1：200的太浓，1：500，没染出来，才调到300

• BOSS2011 (2014-2-08 17:26:50)

  请问斑点印迹具体应该怎么做呢
  谢谢！

• remonte (2014-2-08 17:28:13)

  
  有没有人遇到过一次两块板一起做，一块结果还可以，另一块什么都没有呢？我的意思是同样电泳槽，同样的转膜，我常有这样的现象出现

• greenbee (2014-2-08 17:28:32)

  
  是的，我的也是，经常同时跑两块胶，一起转膜，完了用丽春红染色，其中一张膜的条带就比较漂亮，一张就较差，应该是溶液在电离过程中浓度不均一的问题吧

• seven7 (2014-2-08 17:28:59)

  有没有人遇到过一次两块板一起做，一块结果还可以，另一块什么都没有呢？我的意思是同样电泳槽，同样的转膜，我常有这样的现象出现
  
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  有可能,因为BIO-RAD的转膜仪，转膜的两个胶的位置是不同的，为了达到相同的效果，我们在转膜中途将两块胶换一次位置。我们转膜一般是200mA*120min，转膜液不加SDS.

• redbutterfly (2014-2-08 17:29:53)

  请教各位高手，染胶的考马斯亮蓝是什么比例配的，这种方法是不是可以确定胶上是否有目的条带？

• seven7 (2014-2-08 17:33:45)

  QUOTE:

  原帖由 redbutterfly 于 2014-2-8 17:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  请教各位高手，染胶的考马斯亮蓝是什么比例配的，这种方法是不是可以确定胶上是否有目的条带？

  考马斯亮蓝R250 配方：R250：0.5g；甲醇：250ml；冰乙酸：100ml；定容500ml

• remonte (2014-2-08 17:34:37)

  
  又摸索了一周
  甲醛改为10% 反而只有白片
  增加转膜时间分别 为1.5小时和 2小时 actin 效果很好 但是目的条带还是没出来
  搞笑的是经常会有很浓的黑点 有时候还在marker附近 背景很干净 不知道出来的什么
  用同一张膜做了另一个分子量为150的抗体可以做出来 那说明大分子条带还是能转过去的
  考马斯亮蓝染胶也说明转膜没多大问题
  问：二抗推荐是驴抗羊 我用的是鼠抗羊 这个有没有问题？
  目的蛋白是icam家族的 提取蛋白时是否有什么特别要注意的地方 可以提高提取浓度？
  做出过一次 虽然背景比较高 但是条带还是能认清的 能都说明一抗没问题
  郁闷了 下一步不知道怎么改进 呜呜
  大家有什么好办法 帮忙集思广益下 谢谢

• caihong (2014-2-08 17:34:59)

  
  感觉是你sample有问题。怀疑你提取过程中蛋白降解也许比较厉害。
  目的蛋白130KD应该算是比较大的蛋白了，电泳和转膜的电压不要太高，你用150v电泳太高了，建议用100v-120v左右，时间长些，1-2h。
  你那个150kd能做出来并不能代表这个130也一定可以，两种蛋白的表达量和稳定性你确定一样吗？

• taoshengyijiu (2014-2-08 17:35:58)

  
  我想问一下β-actin42KD的转膜条件，不想过夜的那种，我以前用的是100MA，90min,但是DAB显色没有条带显出来，请指导一下

• seven7 (2014-2-08 17:36:20)

  QUOTE:

  原帖由 taoshengyijiu 于 2014-2-8 17:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  我想问一下β-actin42KD的转膜条件，不想过夜的那种，我以前用的是100MA，90min,但是DAB显色没有条带显出来，请指导一下

  我用半干转，按膜的面积算电流，一般一块胶一张膜26ma，1h就可以了

• vvmmoy (2014-2-08 17:36:37)

  
  做了很多Western的实验，不出条带的原因主要从转膜、二抗和一抗考虑（按照重要性排序）。
  对于130kD的蛋白，转膜时间 100v 1小时是不够的，我们一般是110V，90分钟。LZ可以试试。
  其二，电泳时150 V ，电压太高。电压越低，蛋白条带分离效果越好。建议采用100V，多跑些时间，这样条带会更清晰。
  建议LZ分析下二抗是否坏了。如果是好的，那么就是你 的一抗的问题。分为两个方向：1.浓度不对 2.一抗失效。
  而且你竟然把甲醛的浓度改为10％，这不是不能随便改的呀。转膜液20％浓度的甲醛是无数前辈验证过的，是最佳浓度。

• wmp1234 (2014-2-08 17:37:05)

  
  我做的目标蛋白是45kd的用100v50分钟就转过去了，条带清晰，可以适当调整上样量，转膜液的配制不变

• remonte (2014-2-08 17:37:27)

  谢谢各位指导
  150的能转过去应该能说明我的转膜时间是充足的，因为sample用sds煮过，是不是说明蛋白的带电量和分子形状都统一化，差异比较小了，当然如果原本丰度不足的话是另讲
  改变甲醛浓度主要是考虑分子比较大的缘故，当然这个尝试失败了，没有再试
  用的二抗实验室的没人用过
  考虑到我的蛋白是跨膜一次的膜蛋白，想是不是蛋白提取时溶解的比较少，重新换强裂解液再提，转膜1.5小时，其余条件不变，结果压片的时候发现整张膜都发亮，以前没出现这样的情况，不知道怎么解释
  电泳电压变小条带分的好不好能不能从marker判断啊？如果可以的话，我的marker芬德还是很漂亮的

• seven7 (2014-2-08 17:37:46)

  我以前湿转都是30V过夜的。觉得很耽误时间，最近也想用高电压的湿转，大家能不能给点建议。我的分子量是220KD的。什么条件才能很好的转过去。

• hustwb (2014-2-08 17:38:09)

  
  电泳先用60V跑20分钟过积层胶，然后90V跑到底；
  对于130kd的条带，100V转一小时肯定不够，可适当在转膜液中加SDS（1g/L），110V转两个半小时，电泳槽周围不加冰块，使转膜液温度在50°C左右最好。
  封闭用5%脱脂奶粉1小时就足够了；
  biorad的电泳槽靠近负极的那一张膜转的比较好，你可以先把靠近负极的那个三明治拿出来，靠近正极的再转20分钟效果最好。