【求助】western 癌细胞提蛋白少

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• bling (2014-2-08 21:19:39)

  "每管细胞加400ul裂解液" maybe too much
  when we test the expression, I usually use <100ul lysis buffer for each 6cm plate. This way the protein concentration will be higher. Or you may use speed-vacuum to concentration your sample... or else.
  "移液器反复吹打后置4°C或冰上，30min"...you didn't use sonication. maybe sonication will help lyse the cells more.
  "电泳后染色无条带"...maybe there are bands on the gel, what staining do you use? you couldn't see it because the staining method can't give you the resolution??? you may check that out.. Not Sure.
  

• glass (2014-2-08 21:20:33)

  
  我用的是老式的玻璃培养瓶，细胞不少，也许裂解液是多了。
  这里没条件做超声破碎，着实没办法。
  我用考马斯亮蓝G-250染色，有一次染出来有一条带，但不是我要的大小，并且，细胞总蛋白应该跑出来很多条带吧。
  还是方法不对头，别人从卵细胞提蛋白，几百个细胞提得就能跑出条带来。

• ukonptp (2014-2-08 21:20:53)

  
  我的建议：你是不是要考虑大量的细胞没有消化下来。你的细胞贴壁是否比较牢 ，消化下来之后再看看残留在培养瓶中的细胞还有多少，以此可以估计有多少细胞消化下来了。400ul裂解液裂解裂解一瓶细胞我倒觉得不算多。我平时用六孔板，细胞长到80%满，我都是用300 ul RIPA裂解的，最后出来的条带效果还是很好的。所以可能问题主要是消化下来的细胞实际有多少。
  你为什么去除脱氧胆酸钠？该试剂用于裂解细胞还是很好的。
  酶消化，830rpm，5min离心，为什么不用后面用的1000rpm？为了保证细胞都离心下来，最好还是用1000。
  蛋白酶抑制剂你只用了一种吗？cocktai并不贵的，按照说明书配好后是7倍的，用起来是很方便的。如果蛋白酶抑制剂不够，蛋白长时间保存在-20°c是容易降解的。aprotinin、leupeptin、edta都是常用的。
  蛋白浓度到底有多少？
  确实是需要改进方法。再试一试。祝好运。

• glass (2014-2-08 21:21:12)

  
  多谢大家的建议！
  我认真检查了，这种细胞确实贴壁很牢--改进；
  是因为手头没有脱氧胆酸钠才没加，还是买cocktail吧；
  离心速度是传代用的速度，下次稍提高些；
  没有BSA，蛋白浓度没定量。
  这个指标申请该课题的老师不想做，我争取了一导的支持才做的，但课题不是一导的，所以也不敢多破费。

• xiaoxiaoniao (2014-2-08 21:22:48)

  
  是呀，收细胞830转是太低了；可以试着少加裂解液，提高浓度。封闭我们都是用脱脂奶粉，还可以，也便宜。

• glass (2014-2-08 21:23:57)

  
  相关疾病：
  胃癌
  是HO8910细胞，贴壁很牢。同是我配的胰酶，消化胃癌AGS 5min细胞就起来了，这个细胞十分钟还有很多贴壁的，跟生了根似的，怎么吹也不下来。
  并且，同样的条件，未转染的细胞离心后很明显的细胞团，转染的细胞不明显，提高到1000rpm,6min细胞团也不明显，但弃上清重悬后计数细胞还不少。大家见过这种情况吗？
  封闭？很可惜我还没做到这步。

• glass (2014-2-08 21:24:25)

  
  买cocktail遇到问题：
  我的蛋白可能表达在胞浆，应该用变性的还是非变性裂解液？

• glass (2014-2-08 21:26:08)

  补充：
  克隆的是编码跨膜受体胞外段的基因，如能表达可能是不溶性蛋白。