【求助】关于膜蛋白SDS-PAGE电泳

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-2-08 21:53 作者: BUK 来源: 分析测试百科网

最近在提细菌膜蛋白做SDS-PAGE电泳，用的是超速离心法，膜蛋白用10mM的Tris缓冲液（ph 7.0)，2％Trintionx－100溶解。每孔80ug左右蛋白做SDS-PAGE电泳却看不到条带。我原来是加sds加样缓冲液跟样品煮3min，但是发现沉淀较多，后来没有煮，直接跑电泳，考马斯亮蓝染色，但是结果都一样，没有条带，只在胶的底部看到很多smear一样的东西。我估计是膜蛋白溶解性太差的原因。哪位战友能帮我想办法解决这个问题？

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【求助】关于膜蛋白SDS-PAGE电泳

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HP007 (2014-2-08 21:55:01)

可以试一试用8M 尿素溶解，也可以用TCA 沉淀试试
hustwb (2014-2-08 21:56:44)

似乎urea对膜蛋白的溶解性很差的
对楼主建议
1）先做个western确定下目标蛋白是否表达？因为膜蛋白表达量教低，即使过量表达也只有1mg/l 甚至更低 SDS检测不到很正常
2）保证每步都加有PMSF或者相应蛋白酶抑制剂避免被降解
3）换表面活性剂。不同膜蛋白适用的表面活性剂不同参考文献的选择吧
不过没有参考的话一般DDM是优先选择的。。。尤其对于a-helix膜蛋白。。
兔纸 (2014-2-08 21:57:02)

楼主做的什么菌?
菌是如何破碎的?
用什么方法测定的蛋白浓度?
超速离心离了几次?
另外,上样前最好还是和上样缓冲煮一下
BUK (2014-2-08 21:57:41)

谢谢各位！我做的是金葡菌，不是做蛋白表达。参照文献，我先用溶菌酶加溶葡萄球菌菌先溶菌，再超声破碎，BCA测定蛋白浓度，超速离心100000g，1h，只一次。我不做western,但是western我做过，目的蛋白是有的。我做的是直接sds-page电泳。我看到有人说4M尿素加在分离胶里可以增加膜蛋白在分离胶的溶解度。不知道行不行。我想试一下。
daod (2014-2-08 21:58:10)

我看到一篇文献是在E.coli里表达膜蛋白的，但是也说到了样品的处理方法。你可以参考一下，因为文献我也没有仔细看，就是看了下处理方法。发上来做个参考。

32869724.jpg
兔纸 (2014-2-08 21:59:56)

QUOTE:
原帖由 BUK 于 2014-2-8 21:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

谢谢各位！我做的是金葡菌，不是做蛋白表达。参照文献，我先用溶菌酶加溶葡萄球菌菌先溶菌，再超声破碎，BCA测定蛋白浓度，超速离心100000g，1h，只一次。我不做western,但是western我做过，目的蛋白是有的。我做的是直接sds-page电泳 ...

很多破碎用的是french pressure,G+的是不太好破碎,破碎过程中尽量保持低温。另外，你离心后重新悬浮起来，再离心一次，有助于去除一些杂质。我没加过尿素，不知道效果如何，不过缓冲pH尽量保持在7.5-8.0之间吧。样品最好煮一下，上样前在离心
兔纸 (2014-2-08 22:00:17)

楼上给的TNG buffer可以试一下
BUK (2014-2-08 22:00:38)

问题解决，方法仍然不变，只是换了以前买的南京凯基膜蛋白抽提试剂盒的suspension buffer 溶解膜蛋白，sds－page效果良好。