【求助】关于免疫共沉淀

最新回复

• 小游abc (2014-2-08 22:19:40)

  
  附图，右边上数第二条为我的B的目的条带，第一条为非特异条带。
  所用的抗体均为单抗。

  
  58359271.png

• mod=8048 (2014-2-08 22:20:07)

  没有Marker,你b蛋白一抗与A蛋白一抗是同一种属还是不同种属？2条带确定不是抗体的重链和轻链吗？看你的这个带的位置很像阿。

• tie8 (2014-2-08 22:20:56)

  问题非常多。大的方面：
  1. 首先用RIPA提取蛋白要小心，除非是相互作用很强的蛋白，否则b蛋白可能和a蛋白分开，导致你得不到coIP（免疫共沉淀）的结果。
  2. 将蛋白复合体拉下后，不能用PBS清洗，这样非特异吸附很多。如果你用的RIPA裂解液是可行的话，就用RIPA洗，注意加蛋白酶抑制剂。我这一般用NETN清洗。
  3. Western图首先要做一个input，即你提取的蛋白上个样，分别用A和B的抗体做western,要出相应的条带。第二你做coIP的泳道需要用A抗体做western说明把A蛋白拉下来了；最后才是在该泳道用B抗体做western说明同时把B拉下来了。如tiger22所说，如果你两个抗体都是鼠源单抗，而且用的二抗是抗一抗重链的话，应该有很浓的55kd重链Western条带。

• 小游abc (2014-2-08 22:21:19)

  想继续提几个问题。
  1、如我的图片所示，第二条的条带大小是18KDa左右（和我的目标蛋白大小一致），第一条忘了标记。因为对于免疫学不太熟悉，想请教一下，如果重链是55KDa，那么轻链的大小应该是多少？
  2、因为我的A、B蛋白的分子量分别是6.7Kda和18Kda，做6.7Kda大小的蛋白我用了数个月的时间，终究还是没有作出来，只能做出18KDa的B。因此要如您所说的用A钓B后再用B钓A会有困难。不知道如何解决。
  3、我现在A的一抗有鼠源和兔源的，而B的抗体只有鼠源的。如果我把首次加入的A的一抗换成兔源，而B的一抗继续用鼠源，如果出现B蛋白大小的条带，是否就能够证明？
  非常焦急的等待答复。谢谢！

• 小游abc (2014-2-08 22:23:05)

  
  补充一下，我首先孵育的A的一抗是抗myc标签的抗体，貌似分子量不会很大。

• kswl870 (2014-2-08 22:23:47)

  
  1、如我的图片所示，第二条的条带大小是18KDa左右（和我的目标蛋白大小一致），第一条忘了标记。因为对于免疫学不太熟悉，想请教一下，如果重链是55KDa，那么轻链的大小应该是多少？
  2、因为我的A、B蛋白的分子量分别是6.7Kda和18Kda，做6.7Kda大小的蛋白我用了数个月的时间，终究还是没有作出来，只能做出18KDa的B。因此要如您所说的用A钓B后再用B钓A会有困难。不知道如何解决。
  3、我现在A的一抗有鼠源和兔源的，而B的抗体只有鼠源的。如果我把首次加入的A的一抗换成兔源，而B的一抗继续用鼠源，如果出现B蛋白大小的条带，是否就能够证明？
  非常焦急的等待答复。谢谢！
  1. 轻链的大小是25kd。
  2. 可能是你理解错了，我的意思是在你做CoIP的泳道，即在最右边的那条上做两个western实验，先用抗A的抗体做western证明你把A蛋白拉下来了，然后用抗B的抗体证明同时把B蛋白也拉下来了。
  你说的A蛋白没做出来是啥意思？既然没做出来为啥又用抗myc标签的抗体？你如果是用带myc-tag的外源A质粒和B质粒转染细胞，那研究的是外源A和B的相互作用，还不能说明是内源的A和B相互作用。
  3. 只要条带位置对了，兔源还是鼠源是没关系的。只是我们认为在做CoIP的western时，二抗很可能和一抗的重链反应，所以应该在55kd出条带才对。你可以试试将这几个抗体直接上样走电泳，然后用二抗直接做western看看在55kd有没有条带。

• kswl870 (2014-2-08 22:24:10)

  
  也可能是我表述有点问题：你把beads所结合的蛋白加热走电泳后转膜，先用抗A的抗体做western看看是否有A的条带，然后洗去A的抗体，再加入B的抗体做western看是否有B的条带，如果都有就能说明问题，当然别忘了做你自己提出的mock对照，即用control IgG应该两个条带都不出。如果没有洗去抗体的溶液就上两个泳道走电泳，转膜后一个做抗A的western，一个做抗B的western。

• 小游abc (2014-2-08 22:25:07)

  小弟现有些晕了头了。
  1、现拟将A、B抑癌基因共转染入癌细胞中。已经证实癌细胞是不表达A和B的。
  2、转染时A的分子量为7KDa左右，带Myc标签。B的大小为18KDa。转染细胞在RNA水平均高表达A和B。但是在蛋白水平因为A的分子量太小，没有做处理，只作出来B。荧光显微镜可见A和B。
  3、现打算做A和B的免疫共沉淀。如上所述。讨论A和B是否有联系（且不论是内源还是外源）
  4、最后想问兄，将抗体跑电泳的目的是什么。如果发现55Kd和25Kda的条带说明什么问题。
  再次感谢兄。

• ROSE李 (2014-2-08 22:28:17)

  
  1. A没做出来总觉得不是那么完美。如果A带Myc标签的话，做CoIP时应该设个对照，就是同时将只表达Myc标签的质粒和表达B的质粒共转染细胞，用Myc抗体抓下来后也看看会不会出B带，这样可以排除B和Myc-tag相互作用的可能。
  2. 我认为正常的CoIP在55kd很可能会出条带。抗体跑电泳做western是设个对照，因为你做CoIP后上电泳的混合物里包括抗A的抗体和与A相互作用的蛋白，通过该对照，你可以知道你用抗B的抗体做出的Western条带那些是和抗A的抗体反应的，哪些是和B蛋白反应的。如果发现55kd是正常的。