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【求助】关于EMSA的一些省钱方案
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最近要做EMSA...看了一些资料.查了一下KIT的价格.都好贵.orz
感觉前面核蛋白抽提可以自己配buffer,配方也不是很复杂的样子.但是核蛋白抽出来怎么证明自己抽得好呢?是不是有什么marker可以做一下western?
后面的那个结合,跑胶,检测KIT看了下 pierce的价格要4K左右.里面东西也满多的.
LightShift Chemiluminescent EMSA Kit
Sufficient components for 100 binding reactions and detection reagents for ~800 cm2 of membrane.
Kit contains:
LightShift EMSA Optimization and Control Kit (20148X, available separately)
10X Binding Buffer 1 ml
Biotin-EBNA Control DNA 50 µl
Unlabeled EBNA DNA 50 µl
EBNA Extract 125 µl
Poly (dI•dC) 125 µl
50% Glycerol 500 µl
1% NP-40 500 µl
1 M KCl 1 ml
100 mM MgCl2 500 µl
200 mM EDTA pH 8.0 500 µl
5X Loading Buffer 1 ml
Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module (89880, available separately)
LightShift Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate 1.5 ml
LightShift Luminol/Enhancer Solution 80 ml
LightShift Stable Peroxide Solution 80 ml
LightShift Blocking Buffer 500 ml
LightShift 4X Wash Buffer 500 ml
LightShift Substrate Equilibration Buffer 500 ml
但是除了最后检测BIOTIN的以外,别的貌似都可以自己配?转的膜之类的有特殊要求么?一般做WB用的hybond-c行不行?
binding buffer我查了一下比较老的文献,查到了.不过是用P32做标记的体系.应该影响不大? POLY(DI.DC)公司可以合成么?长度是多少的?
两个KIT实在太贵了..万一做不出来压力太大了.TOT 谢谢各位省钱达人..
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最新回复
PPT (2014-2-08 23:14:50)
但是刚好我用的就是Pierce的试剂盒，给一点我的心得：
这个试剂盒的确挺贵，但是效果也很好（至少我个人感觉不错），由于之前没做过，而且不想做放射性同位素实验，所以就强烈建议老板买了，当时也没想那么多。幸好当时我的老板也不想沾放射性同位素，所以就同意了。可能我运气也比较好，做了一次就成功了，所以我们实验室后来的人都用这个试剂盒。
个人感觉如果严格按照manual来做，成功的可能性很大。而且在正式实验之前做好一些预实验，尽量做到万无一失。这个试剂盒好像可以用于检测100个实验（如果按一块mini胶10个泳道的话就是大概10块胶），我的建议是第一次实验可以严格按照manual来做，各种试剂用量用足。如果成功后，你可以看看那些用量是可以减少的，这样就可以节省试剂盒。我印象最深的是试剂盒对抗体的用量是挺大的，所以可以在短时间内完成结合（好象是15min），而一般的实验是1-2小时。所以抗体量可以减少，增加温育时间。或者你可以在成功后试试自己DIY试剂盒，这样就节省很多了，就是Biotin检测也能自己买到的。
一开始自己DIY的缺点是不知道自己的体系如何，而且可能需要优化，而试剂盒可以免除这些烦恼，一旦自己比较熟悉了，完全就可以DIY了。
由于我原来是做原核的，所以对你的核提取不了解。
xueyouzhang (2014-2-08 23:15:08)
张先生 (2014-2-08 23:16:00)
QUOTE:
我用的是湿转，和western blotting差不多，用的都是Bio-rad的mini-gel，只是用的是PAGE，0.5*TBE buffer。转膜以后检测一下PAGE上还有没有片段，膜上的DNA我是用紫外固定的，我就直接做了，没有测定转膜的效果。张先生 (2014-2-08 23:16:54)
lorri (2014-2-08 23:17:14)
哈哈，照这么说via的盒子通用型的，50次反应的才1850元，效果也不错啊，也省钱！
gogo (2014-2-08 23:17:35)
还是自己配的最省钱，可惜我还没做出来 -。- 等做出来我会交流经验的
反正碧云天的就别买了等于扔钱。
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