【求助】关于SDS-PAGE的问题

最新回复

• yapuyapu (2014-2-08 23:20:17)

  你的样品是怎么处理的？
  你的电泳条件呢？
  只是这张图的话，基本只能说是脱尾，具体是什么原因引起的，就要看你的实验条件了。

• qhyu (2014-2-08 23:20:39)

  
  样品处理：称取1克原球茎；加提取液2.5ml在冰浴下研磨20min，到入离心管，于12000r/min离心20min；取上清液加4倍冷丙酮沉淀，风干沉淀，去50mg溶于100微升样品缓冲液里加热5-10min，6000r/min离心，上样。
  电泳条件：压缩胶4%，分离胶12%。压缩胶电流为10mA，分离胶为15mA.

• panda王 (2014-2-08 23:21:02)

  QUOTE:

  原帖由 qhyu 于 2014-2-8 23:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  样品处理：称取1克原球茎；加提取液2.5ml在冰浴下研磨20min，到入离心管，于12000r/min离心20min；取上清液加4倍冷丙酮沉淀，风干沉淀，去50mg溶于100微升样品缓冲液里加热5-10min，6000r/min离心，上样。
  电泳条件：压缩胶4%，分离胶12% ...

  
  没有做过类似的课题
  只是想问一下，这个protocol 有文献支持？可靠性有多少。

• txwuyan (2014-2-08 23:21:19)

  
  50mg溶于100微升样品缓冲液
  Protien concentration was so high. For western blot, 50ug/well is enough.

• 大脑门儿儿 (2014-2-08 23:21:37)

  退色还没退干净，其他的可能是样品的问题。

• greenbee (2014-2-08 23:24:09)

  我也是刚开始做wb，前两周也遇到了相似的问题，并且电泳的条带很不整齐，近似曲线。别人说胶做的不好，换了AP还是那样。后来，我把以前的东西全扔了，重新配的试剂，今天刚跑上电泳，还不错。

• PPT (2014-2-08 23:26:27)

  跑胶的时候要注意电压的大小，我感觉你的电压是不是有点大了，不同的电泳槽，具体的电泳时候电压是有差别的，没必要都 要按照说明书上的要求来，要根据自己的实际情况调整，还有就是脱色时候要注意染色时间的长短！

• qhyu (2014-2-09 00:02:12)

  QUOTE:

  原帖由 panda王 于 2014-2-8 23:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  
  没有做过类似的课题
  只是想问一下，这个protocol 有文献支持？可靠性有多少。

  浙江大学的林伟强等，就用铁皮石斛的原球茎提取热稳定蛋白跑电泳啊。我提的是总蛋白。

• dmg (2014-2-09 00:02:43)

  怀疑你的胶配制有问题，你配好的胶有没有充分搅匀？你的图是不规则的，可能是胶凝的不均匀？植物蛋白没做过，样品处理不知道有没有问题。一般是用恒压吧，还没用过恒流跑。还有，你的胶脱色没干净，背景还都是蓝的。

• qhyu (2014-2-09 00:03:05)

  
  听了各位高手的意见后，我减小了上样量，降低了电压，效果好多了。真是非常的感谢各位。但是跑出来的条带拖尾现象很严重，我延长加热的时间，加热后10000r离心，拖尾现象还是严重。还望各位高手指点指点。

• dmg (2014-2-09 00:03:36)

  
  胶的问题，分离胶配好后没用无水乙醇压。样品稍微离心下即可。

• qhyu (2014-2-09 00:04:00)

  QUOTE:

  原帖由 dmg 于 2014-2-9 00:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  胶的问题，分离胶配好后没用无水乙醇压。样品稍微离心下即可。

  压了的啊，是用异丙醇压的，还有一个问题就是溴酚兰不是程一条很细的线，而是比较宽，比较淡，这是什么原因呢？对电泳的结果有影响吗？

• dmg (2014-2-09 00:04:26)

  
  上样是否一样？为防止边缘效应没加样的孔加同样体积的上样缓冲液

• qhyu (2014-2-09 00:05:26)

  QUOTE:

  原帖由 dmg 于 2014-2-9 00:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  上样是否一样？为防止边缘效应没加样的孔加同样体积的上样缓冲液

  上样是一样的，而且没有加样的孔也加了上样缓冲液的。

• gogo (2014-2-09 00:05:47)

  我也是跑植物蛋白，提取后也取提取液加loading buffer煮样后电泳，但没出现过这样的情况。看你的胶是没有凝好，制胶时加好各种试剂后先晃动2Min吧，混匀后凝的会比较均匀，不要急于加入到板内，加完了左右摇动使胶面较平整，再用水或异丙醇封胶。你的样品盐浓度太大了，可以不要上那么多样试下吧。

• yes4 (2014-2-09 00:06:18)

  
  样品浓度大，也不会出现这样的问题。
  我担心是犯了什么低级错误导致的。
  楼主能不能说一下制胶时，上层和下层 的 配方。

• qhyu (2014-2-09 00:06:35)

  
  分离胶（12%）Acr-Bis H2O  分离胶缓冲液 10%APS 10%TEMED
     12.8ml   11.2ml   8ml   150μl 150μl
  压缩胶（4%）:Acr-Bis H2O  压缩胶缓冲液 10%APS 10%TEMED
     1.5ml   6ml   2.5 ml   60μl 100μl
  制胶时都是使劲摇匀，抽气了的。分离胶用异丙醇压得很平整。溴酚兰不是程一条很细的线，而是比较宽，比较淡，这是什么原因呢？对电泳的结果有影响吗？

• qhyu (2014-2-09 00:07:49)

  奇怪了，上周我把电压降下来，减少上样量就能跑出11条带了，但现在在同样的条件下却跑不出来了，结果和上面那张胶一样，只是颜色浅了点。我分析可能是由于天冷了，样品缓冲液里的SDS结晶出来了，所以在加样品缓冲液之前先把它放入27度烘箱中，过段时间摇匀后在和样品混合加热上样。可是跑出来的结果还是和以前一样。真是愁人啊，还有就是这几次电泳的时间比以前多了两三个小时。我现在真是不知道是怎么回事了，请高手帮帮我。

• ha111 (2014-2-09 00:08:28)

  
  我以前遇到过这样的问题 经验是：1.样品浓度太大了 2.蛋白已经讲解3.电流不稳定 4.在冰水环境跑电泳（你是不是在冰箱或者冰水环境跑电泳啊）
  楼主的问题最可能是样品浓度太大了或者在上样前蛋白就已经降解了，我以前做植物蛋白就是这样的。你重新制样试试看

• ha111 (2014-2-09 00:08:47)

  你的AP、TEMED怎么加的那么多？？？