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【求助】WB做不出目的条带，大家帮帮忙
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大家好，我做WB快两个月了，可是目的蛋白条带总不出来，我的条件是
5%浓缩胶，12%分离胶，30%聚丙烯酰胺，上样100微克；1X电泳液：Tris3.03g 甘氨酸9.4g，SDS1g,加水至1L,4°保存，分离胶60V40min左右,浓缩胶120V90min左右；跑完后胶用去离子水洗一下；转膜100mA约2h10min左右，转后用丽春红和考马染膜和胶，觉得还是转的完全，用水洗膜上的丽春红，用5%milk的TBST(0.605gTris,4.4gNaCl、吐温20加0.25ml加水至500ml)封闭37°2h,水漂洗一下，一抗1：200后4°过夜（约14h），TBST3次每次5-10min;二抗1：2500后37°约2h,TBST3次每次5-10min；DAB显色。我的目的蛋白是FAS（45KD），Bcl-2(26kd),p53(53kd),抗体都是博士德的，膜是0.45微米的NC膜，另外，转膜液我的是5.8gTris,2.9g甘氨酸，SDS0.37g甲醇200ml,Hcl调ph8.3加水至1L,4°保存，可我看了还有一种是3.03gTris,甘氨酸14.4g,甲醇200ml,加水至1L（这种配方没加SDS），哪种要适合我一些？谢谢大家
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最新回复
ffooll (2014-2-09 00:27:32)
我觉的你的转膜液配方比较怪，我们用湿转的话是1.93gtris，9g glycine，PH 7.5,150ml甲醇，定容到一升。200mA转90min。
另外抗体可靠性是否有保证？
2541 (2014-2-09 00:27:49)
1.首先怀疑你的0.45的膜，膜最好用0.22的
2.怀疑你的抗体。你的一抗1：200，这个抗体的原液浓度未必太低了吧。你说的这个公司的抗体貌似不是很好，还是买进口的。据说这个公司做原位杂交的试剂还是可以的。其中我们 实验室做P53这个公司的试剂做免疫组化目前还没有做出来，买的进口的P53已经WB出来了。
3，想问问你 你显影时看见ECL 发光了吗？
芙蓉宫主 (2014-2-09 00:28:36)
谢谢以上两位战友，由于试验经费，没法买进口抗体，这博士德的也才买来2个多月，应该不过期；还有我用的是DAB显色，想问问laohu02215 ，你们的p53抗体是进口哪公司的？规格是多大？价格呢？还有你们测的是野生型还是突变型，我看有的说WB只能测突变型的，真的吗？另外，我的一抗是兔抗鼠的，二抗是羊抗兔的，没买错吧。谢了
ffooll (2014-2-09 00:28:58)
我的一抗是兔抗鼠的，这是什么意思？是Rabbit anti－mouse P53?一般来说一抗没有说这样说的，要不是Rabbit polyclone antibody，goat polyclone antibody，就是mouse monoclone antibody。二抗才通常说羊抗兔或羊抗鼠，你好好查查吧
芙蓉宫主 (2014-2-09 00:29:22)
ha111 (2014-2-09 00:29:43)
我最近也在做Bcl-2(26kd)，感觉挺好的
1.电转的时间你有点长，我的方法是15V，20-30min
2.小分子量的蛋白最好用0.22的PVDF膜
3.加SDS转50kd以上的感觉要好些，不加转50kd以下的
4.注意到你用的是NC膜，NC膜是不能泡甲醇的，直接在转移液中浸一下马上用
5.二抗1：2500可能还是低了点，而且有些二抗里面还加有甘油，这样就更低了，建议1：1000
eric930 (2014-2-09 00:30:14)
不过前提是……你确定你样品里面有这个蛋白哦，种属也没错？
芙蓉宫主 (2014-2-09 00:30:36)
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