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标题:【求助】离子交换

米囡[使用道具]
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发表于 2014-2-10 14:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】离子交换


可溶性表达的三个蛋白大小分别是46KD、43KD、39KD、PI分别为9.6、8.2、6.6，都是在PET32里面融合表达的，我今后可能要切掉标签再进行HRP标记，现在关键是老板要我得到很纯的蛋白，老板要我结合离子交换和凝胶过滤纯化，但他提醒我选胶的时候要刚性好的，我个人觉得先离子交换再亲和层次应该能得到很纯的蛋白了，大家能不能帮我推荐用什么离子交换胶比较好啊？
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米囡[使用道具]
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发表于 2014-2-10 14:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 米囡 于 2014-2-10 14:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

可溶性表达的三个蛋白大小分别是46KD、43KD、39KD、PI分别为9.6、8.2、6.6，都是在PET32里面融合表达的，我今后可能要切掉标签再进行HRP标记，现在关键是老板要我得到很纯的蛋白，老板要我结合离子交换和凝胶过滤纯化，但他提 ...

为什么不用阴离子交换剂呢？可以说的具体点吗？
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发表于 2014-2-10 14:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可溶性表达的三个蛋白大小分别是46KD、43KD、39KD、PI分别为9.6、8.2、6.6，
条件不充分，这是指融合蛋白还是目标蛋白？
酶切后应该现Ni柱亲和层析，后离子交换，阴阳均可。分子筛不可取，不可能分开。
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米囡[使用道具]
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发表于 2014-2-10 14:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 Darcy 于 2014-2-10 14:58 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

可溶性表达的三个蛋白大小分别是46KD、43KD、39KD、PI分别为9.6、8.2、6.6，
条件不充分，这是指融合蛋白还是目标蛋白？
酶切后应该现Ni柱亲和层析，后离子交换，阴阳均可。分子筛不可取，不可能分开。 ...

目前的大小是融合的，我是问酶切前的纯化选用什么离子交换介质比较好，酶切之后应该过一次亲和层析就可以了吧？
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lxh031[使用道具]
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 小中大
楼主好，我跟你做的蛋白差不多，融合表达后，想用交换柱纯化一下，想问楼主，你这些蛋白的等电点PI是怎么知道的? 我知道我这个蛋白的基因，但不知道等电点怎么得到，多谢。
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utt0989[使用道具]
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发表于 2014-2-10 15:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

等电点 可以通过软件 得到如DNASTAR
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发表于 2014-2-10 15:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
在柱酶切行不行啊？如果可以这多干净啊？
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Darcy[使用道具]
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 小中大


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原帖由 米囡 于 2014-2-10 14:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


目前的大小是融合的，我是问酶切前的纯化选用什么离子交换介质比较好，酶切之后应该过一次亲和层析就可以了吧？

酶切前用什么离子交换介质，阴阳都可以，要看你的试验结果来确定，没有一定之规，一般pI9.6的可选SP，pI6.6的可选Q，pI6.6的两个都要试一试。
酶切后纯化只用亲和不一定可以得到很纯的蛋白，每种蛋白的个案都不一样，和你的酶切效率，酶切的结果都有很大关系。
你那两个pI碱性的蛋白比较好办，酶切后亲和加Q柱，收集流穿液皆可。酸性的蛋白要看酶切后的目标蛋白pI是多少了，单从已知条件来看大约在7.0左右，阴阳离子交换柱都要试一试，Q用pH8.0吸附，分段洗脱，SP用6.0吸附，分段洗脱。
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Darcy[使用道具]
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 小中大

pI6.6的两个都要试一试
笔误：应为pI8.2的两个都要试一试
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发表于 2014-2-10 15:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

先上NI柱，再根据PI选择离子交换，应该就得到比较纯的融合蛋白，然后再上NI柱，在柱上酶切，OK！
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