【求助】离子交换

最新回复

• 米囡 (2014-2-10 14:58:36)

  QUOTE:

  原帖由 米囡 于 2014-2-10 14:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  可溶性表达的三个蛋白大小分别是46KD、43KD、39KD、PI分别为9.6、8.2、6.6，都是在PET32里面融合表达的，我今后可能要切掉标签再进行HRP标记，现在关键是老板要我得到很纯的蛋白，老板要我结合离子交换和凝胶过滤纯化，但他提 ...

  为什么不用阴离子交换剂呢？可以说的具体点吗？

• Darcy (2014-2-10 14:58:59)

  
  可溶性表达的三个蛋白大小分别是46KD、43KD、39KD、PI分别为9.6、8.2、6.6，
  条件不充分，这是指融合蛋白还是目标蛋白？
  酶切后应该现Ni柱亲和层析，后离子交换，阴阳均可。分子筛不可取，不可能分开。

• 米囡 (2014-2-10 14:59:22)

  QUOTE:

  原帖由 Darcy 于 2014-2-10 14:58 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  可溶性表达的三个蛋白大小分别是46KD、43KD、39KD、PI分别为9.6、8.2、6.6，
  条件不充分，这是指融合蛋白还是目标蛋白？
  酶切后应该现Ni柱亲和层析，后离子交换，阴阳均可。分子筛不可取，不可能分开。 ...

  目前的大小是融合的，我是问酶切前的纯化选用什么离子交换介质比较好，酶切之后应该过一次亲和层析就可以了吧？

• lxh031 (2014-2-10 14:59:52)

  楼主好，我跟你做的蛋白差不多，融合表达后，想用交换柱纯化一下，想问楼主，你这些蛋白的等电点PI是怎么知道的? 我知道我这个蛋白的基因，但不知道等电点怎么得到，多谢。

• utt0989 (2014-2-10 15:00:13)

  
  等电点 可以通过软件 得到如DNASTAR

• moonlight45 (2014-2-10 15:00:36)

  在柱酶切行不行啊？如果可以这多干净啊？

• Darcy (2014-2-10 15:01:08)

  QUOTE:

  原帖由 米囡 于 2014-2-10 14:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  
  目前的大小是融合的，我是问酶切前的纯化选用什么离子交换介质比较好，酶切之后应该过一次亲和层析就可以了吧？

  酶切前用什么离子交换介质，阴阳都可以，要看你的试验结果来确定，没有一定之规，一般pI9.6的可选SP，pI6.6的可选Q，pI6.6的两个都要试一试。
  酶切后纯化只用亲和不一定可以得到很纯的蛋白，每种蛋白的个案都不一样，和你的酶切效率，酶切的结果都有很大关系。
  你那两个pI碱性的蛋白比较好办，酶切后亲和加Q柱，收集流穿液皆可。酸性的蛋白要看酶切后的目标蛋白pI是多少了，单从已知条件来看大约在7.0左右，阴阳离子交换柱都要试一试，Q用pH8.0吸附，分段洗脱，SP用6.0吸附，分段洗脱。

• Darcy (2014-2-10 15:01:25)

  
  pI6.6的两个都要试一试
  笔误：应为pI8.2的两个都要试一试

• one (2014-2-10 15:01:43)

  
  先上NI柱，再根据PI选择离子交换，应该就得到比较纯的融合蛋白，然后再上NI柱，在柱上酶切，OK！

• 米囡 (2014-2-10 15:02:09)

  楼主好，我跟你做的蛋白差不多，融合表达后，想用交换柱纯化一下，想问楼主，你这些蛋白的等电点PI是怎么知道的? 我知道我这个蛋白的基因，但不知道等电点怎么得到，多谢。
  
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  用DNAStart软件翻译成氨基酸序列后，可以自动算出来。

• 米囡 (2014-2-10 15:05:58)

  酶切前用什么离子交换介质，阴阳都可以，要看你的试验结果来确定，没有一定之规，一般pI9.6的可选SP，pI6.6的可选Q，pI6.6的两个都要试一试。
  酶切后纯化只用亲和不一定可以得到很纯的蛋白，每种蛋白的个案都不一样，和你的酶切效率，酶切的结果都有很大关系。
  你那两个pI碱性的蛋白比较好办，酶切后亲和加Q柱，收集流穿液皆可。酸性的蛋白要看酶切后的目标蛋白pI是多少了，单从已知条件来看大约在7.0左右，阴阳离子交换柱都要试一试，Q用pH8.0吸附，分段洗脱，SP用6.0吸附，分段洗脱。
  
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  为什么是先亲和再离子交换啊？我看有关蛋白纯化方面的资料都是说离子交换一般都是作为首选的方法啊。两个先后关系不通影响大不大啊？

• 米囡 (2014-2-10 15:08:28)

  
  有哪位专家知道DEE-Sepharose CL-6B、DEAE-Sepharose Fast Flow 、Q-Sepharose FF、S-Sepharose Fast Flow 、SP-Sepharose Fast Flow 的区别啊？