【求助】WB做不出来,都二十次了

最新回复

• avi317 (2014-2-10 16:53:57)

  ABC作用半个小时?
  你是说AB液？怎么要作用这么久呢，几分钟就足够了。时间长了要粹灭，你当然爆不出来。
  用TBST洗膜。
  还有，你提蛋白的时候不要用SDS.改用别的提蛋白配方。或者买现成的也行。

• uuooii (2014-2-10 16:54:23)

  
  请用考马氏亮蓝染色，确定蛋白已经分离，先。

• 831226 (2014-2-10 16:55:04)

  
  你先要确定自己的蛋白提出来了没有啊？虽然是同样的东西，但是细节决定成败，你一步步检测嘛，
  蛋白定量，假如不方便操作那就跑胶后用考马斯亮蓝染色，看看有没有蛋白条带，如果有基本上可以说是提到了东西，但是有没有目的东东好不确定，
  然后就转膜了，转膜后的胶再染，看看有没有残留，另外膜用立春红染，如果可以看到条带那么说明转膜基本成功，但是你要看看大小分子是不是都转到了，摸一个适合的条件，时间长了小分子蛋白跑了，短了，大的又过不去，如果你的蛋白都偏小的话建议转膜液中多加点甲醇，最好每次用新配的，不然小的容易转过头（我们做的蛋白跨度是35kd-130kd，恒流300ma 2h）
  后面的应该也需要去慢慢排除了，既然你说你师兄他们做的出来那就说明你的抗体是好的，先把内参做出来吧~再去查找一下细节~有时候实验就是要慢慢查找的！
  祝你好运~

• zhy平平 (2014-2-10 16:55:31)

  
  以上几步我都查过了，每次转膜之前我都会先跑下胶染色，都有蛋白条带的,才进行下一步,然后转膜后胶染色也会呀,都可以看到转走了,而膜真的没有染过,因为听说染了不好做了,而且我们这里没有染膜的习惯呀,
  我的问题是现在有条带,都是出现在膜的上面三分之一,都不是目的条带,因为我后来根据marker只转目的条带上下的一部分蛋白,还是做不出来 ,最奇怪的就是为什么总是膜的上面三分之一有条带,下现没有.一直好难以理解,
  谢谢大家的分析,!

• zhy平平 (2014-2-10 16:56:05)

  
  我今天又做了,内参做出来了,但是还看到膜的上面有一条明显的非特异性的条带,我想是不是发光液呀,因为我们的膜都放在保鲜膜里面的,可能上面堆了一些发光液,刚好形成一条呀,谢谢大家!

• ending (2014-2-10 16:57:55)

  
  哎 我也遇见了 类似的问题 膜上部三分之一是很顽固 很固定的 强发光条带 每次都是 昨天看到了 零星的关于‘鬼带’的介绍和解决办法 说是 上样中的DTT在变性蛋白时被氧化而失效导致蛋白聚合引起的 可以在变性后 加样前补DTT（适量 我也不知道多少）以求改善 我还没有来得及试 希望和兄弟一起早日得到理想的结果。。

• zhy平平 (2014-2-10 16:58:37)

  
  哦，还有这事呀，哪要怎么加呀，兄弟搞定后说下啊，谢谢！！！！

• plaa (2014-2-10 16:58:59)

  
  下边条带没有会不会是转膜转过头了呢？有非特异性的条带有可能是一抗浓度过高了，因为我刚开始做的时候就是有非特异性条带，现在把一抗的浓度缩小了一倍就没有这个问题了

• hold住 (2014-2-10 16:59:21)

  
  你的蛋白裂解液用的有问题
  高浓度SDS蛋白提取液我做过，我们提取骨骼肌中的titin蛋白，分子量3000KD，60度水浴5min，室温孵育1h，离心提取蛋白
  我建议你用RIPA或其他的蛋白提取方法试试
  蛋白的提取与前处理是WB最重要的

• zhy平平 (2014-2-10 16:59:48)

  
  其实一直来做，都用这种方法，别人用同样的提取方法都可以做出来，包括现在还有人在用都可以做出来，如果真的是不行的话用哪种提取裂解液方法可能会好点吗？谢谢！

• yychen (2014-2-10 17:00:07)

  
  我的情况也类似。不过我的内参能出来（β-actin),会不会是裂解液有问题，你看看RIPA裂解液试试，另外，二抗我是用5%milk+TBST孵育的37°约2小时。内参能出，可目的蛋白没有，我也正压抑呢，祝你顺利！

• yychen (2014-2-10 17:00:37)

  
  那个对了，RIPA裂解液博士德有，我以前用自己配的，后来目的条带没有我就买了他们的，不过还是没有，你可以看看。