【求助】PVDF膜上蛋白条带全部曝光

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-2-10 17:07 作者: bhka 来源: 分析测试百科网

请有经验的站友诊断一下。昨天晚上和今天晚上曝光两次，目的蛋白似乎有出现，很淡，很细，PVDF膜上的其他非特异蛋白条带也全部曝光，是怎么回事啊？
我的试验参数如下：
1、8%的分离胶电泳时间（浓缩80V+分离胶110V 大概100min）；
2、转移参数：转移液新鲜配制
恒流 300mA 时间320min
3、封闭：10%脱脂奶粉 1H
4、一抗：1：500 孵育过夜后，室温摇床孵育2小时
5、二抗：1：10000 室温孵育3H
6、一抗、二抗的洗涤时间皆是15min*3次
有人建议从以下三方面来改进：
1、采用10%的脱脂奶粉作为封闭液得提前三小时配制，以免封闭时未溶的蛋白颗粒影响结合；
2、降低一抗的孵育浓度，延长孵育时间
请问站友们哪些步骤需要改进啊接下来如何摸索。。。

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【求助】PVDF膜上蛋白条带全部曝光

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最新回复

bhka (2014-2-10 17:07:37)

图片2
曝光5min

27073953.jpg
bhka (2014-2-10 17:08:05)

曝光10min

37115044.jpg
yes4 (2014-2-10 17:08:23)

这个也不是什么全部条带曝光
就是背景太深
降低一抗的浓度
1：1000-1：2000
结果一定会不错
bhka (2014-2-10 17:10:05)

弱弱问一下
一抗的说明书是1：100~1：500.。。。
我用的1：400 用1：1000 是不是太低了？
tuuu2 (2014-2-10 17:11:36)

降低一抗二抗的孵育时间
H2O (2014-2-10 17:11:54)

建议延长孵育的时间。甚至可以4度过夜试试。
bhka (2014-2-10 17:13:06)

一抗已经是4度过夜啦过夜后还尝试室温摇两小时了不行。
jujuba (2014-2-10 17:13:53)

你简直就在说我的问题.目前还在改进条件中,唉!
bhka (2014-2-10 17:14:21)

QUOTE:
原帖由 jujuba 于 2014-2-10 17:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

你简直就在说我的问题.目前还在改进条件中,唉!
搞定的时候记得传授一下经验我也得好好改进一下条件。。
utt0989 (2014-2-10 17:14:41)

一抗用脱脂奶粉TBST配
bhka (2014-2-10 17:15:02)

QUOTE:
原帖由 utt0989 于 2014-2-10 17:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

一抗用脱脂奶粉TBST配
一抗就是用10%的脱脂奶粉溶于TBST配制的
lxh031 (2014-2-10 17:15:22)

你转膜是湿转吗?我们都是25-30min,当然这是根据你的蛋白分子量来说的,但是我们的40几KD的都是25min左右,100KD 的也大概30几min啊
bhka (2014-2-10 17:16:14)

QUOTE:
原帖由 lxh031 于 2014-2-10 17:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

你转膜是湿转吗?我们都是25-30min,当然这是根据你的蛋白分子量来说的,但是我们的40几KD的都是25min左右,100KD 的也大概30几min啊
我的蛋白是120KD，采用湿法转膜，恒压100V ，4小时，你们时间那么短是采用半干转吧？
04906 (2014-2-10 17:16:32)

二抗室温摇床1h就够了1：1000
配抗体应该是5%的牛奶吧
kuaizige (2014-2-10 17:17:19)

可能存在的问题：
1. 一抗浓度过高（请认真阅读一抗说明书，做WB一般稀释度是1：500-1：2000）
2. 封闭不过关，引发较强非特异性染色（个人经验用pbst or tbst配制5%脱脂奶粉作为封闭液及抗体的稀释液）
3. 一抗二抗后洗膜不到位，应该多洗几遍，以除去非特性显色
XYZQ (2014-2-10 17:17:37)

二抗以后多洗一会，15*4，二抗时间可以短一些。