【求助】请大家看看我的WB，是背景太高么？

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-2-10 17:46 作者: 89tongzijun 来源: 分析测试百科网

最近做WB都是这样，曝光后先是像白板一样，可见隐约的条带，调整之后才看到条带。我的蛋白上样量在50—60ug，转膜后立春红染膜可见明显的条带，转过的胶考染后没有条带。转膜后的步骤：
含5%脱脂牛奶的TBST室温封闭1.5-2h---->一抗1：1000，一抗稀释液为5%BSA的TBST，4度过夜大概12小时---->TBST洗10min*3次---->二抗1:3000，室温，2h---->TBST洗10min*3次---->ECL液覆盖膜上约一分钟，显影（bio-rad显影仪），一般是30s曝光一次共曝光10次

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89tongzijun (2014-2-10 17:47:08)

上一张经过调整后，中间那个最深的应该是目的条带

71440492.jpg
jrwyyplt (2014-2-10 17:47:25)

感觉一抗特异性不好,不知是单抗还是多抗.
当然出现多条带也不排除,目的蛋白是不是形成二聚体,或者是有什么修饰.
89tongzijun (2014-2-10 17:47:58)

但是同一张膜经过strip，再封闭，加一抗，二抗，显影后就没有杂带了，但是还是不太清晰，不知道这种图是不是叫背景高？
DDD (2014-2-10 17:48:17)

请问你用的strpping buffer,啥配方
89tongzijun (2014-2-10 17:48:37)

QUOTE:
原帖由 DDD 于 2014-2-10 17:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

请问你用的strpping buffer,啥配方
是买的stripping buffer~~
ssonglikihi (2014-2-10 17:48:54)

TBST 洗的时间延长至15min三次呢
TAT (2014-2-10 17:49:11)

建议降低蛋白上样量
89tongzijun (2014-2-10 17:49:44)

文献上这种蛋白的上样量也达到50ug 呢
第一张图上看的条带已经很淡了，上样量还可以再降么？
linlinstar (2014-2-10 17:50:02)

我认为和上样量关系不大
89tongzijun (2014-2-10 17:50:23)

QUOTE:
原帖由 linlinstar 于 2014-2-10 17:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

我认为和上样量关系不大
那是什么原因呢？
linlinstar (2014-2-10 17:50:48)

QUOTE:
原帖由 89tongzijun 于 2014-2-10 17:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

那是什么原因呢？

一抗特异性不好
TBST洗膜时间偏少
89tongzijun (2014-2-10 17:51:09)

一抗是CST的单抗，特异性不好可不可以加大点浓度？
eric930 (2014-2-10 17:51:38)

特异性不好应该是降低浓度吧，比如说1：2000
89tongzijun (2014-2-10 17:52:04)

QUOTE:
原帖由 eric930 于 2014-2-10 17:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

特异性不好应该是降低浓度吧，比如说1：2000
正在尝试，其实说明书的浓度推荐的就是1：2000
windy+++ (2014-2-10 17:52:26)

我做的蛋白条带非特异杂带很多，是什么原因啊？请各位大侠帮忙解释
9900 (2014-2-10 17:52:44)

如果条带多，最有可能就是一抗浓度太高了，你可以稀释到1：2000试试，而且你洗膜可以洗15minX4次，只要转上了，洗4次肯定是洗不掉的，不用担心这个
你曝光后白板一样是什么意思啊，这不是有条带了啊