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【求助】已经做了两个多月还没有条带,急

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-2-10 21:26    作者: windboy    来源: 分析测试百科网

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【求助】已经做了两个多月还没有条带,急
自己是新手，自己做自己的目的蛋白已经两个多月了，一直没有结果，很着急，我的方法过程是这样的。
1。自己的蛋白是组织蛋白，刚提取的，目的蛋白是20kd的。
2.用5%的浓缩胶，15%分离胶。
3.上样量每个泳道70ul.用恒压浓缩胶电压是180v,电泳30分钟到分离胶，然后改成200v,电泳1h.
4.转膜，用NC（考虑经费少）0.22um,转膜时间1h.丽春红染色有蛋白，但是条带不是分的很清楚。
5.用5%脱脂奶粉封闭一个小时。
6.加一抗1：500（抗体是从cst公司买的）在4度冰箱过夜。
7.取出抗体，用PBST洗三次，每次10分钟。加入二抗1：2000（国产的）封闭一个小时。常规洗三次。
8.到暗房加AB液，显影定影用的是配好的试剂盒。
就是没有结果，记得有一次条带还能看点，只是很模糊，后来就没有看到过。我用别人的抗体能够有条带，别人的抗体 是56kd的。蛋白应该没有问题，大家帮我看看吧，谢谢！
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最新回复

  • youyou99 (2014-2-10 21:26:27)

    转膜时间长了? 等着高手来解答

  • windboy (2014-2-10 21:26:52)

    谢谢，我转膜时间曾摸索过，40分钟，50分钟，但是还是不理想。

  • shanzhapia696 (2014-2-10 21:27:12)


    我也是做了一段时间才做出来的，我的目的蛋白分子量是19KD
    1、20KD的蛋白用12%胶比较好，小于10KD的用15%
    2、上样量是否过多？没空最好不要超过30微克，在电泳前做个蛋白定量（BCA法）
    3、你跑胶的电压太大了，浓缩胶一般60～100V,分离胶一般100～120V，我用的是浓缩胶80V, 30JMIN,分离胶100V, 80～100min
    4、转膜是半干法吧，我用的是20V 40MIN,20KD的绝对能转上，也不会转过，我用的是百乐的仪器。如果一直没有条带，可在转膜后分别然胶和膜，如果都没有条带，那就是缓冲液的问题
    5、还有实验下二抗和发光底物，将二抗稀释后加发光底物，在黑暗处应该可见到荧光，如果没有就要检查下二抗和底物是否有问题
    6、最后定影和显影液也不要过期了

  • windboy (2014-2-10 21:30:14)

    谢谢楼上的指点。按照你的意思，我回去调整下电泳的电压。我想问下电压大的话对小蛋白有什么影响，是不是把小蛋白分散了？

  • windboy (2014-2-10 21:33:11)

    还有不明白，电泳时，浓缩胶可以把上样蛋白压成一条直线往下跑，但是到分离胶后，压缩的溴分蓝开始扩展成一定宽度往下跑，是不是也应该是一条直线往下跑啊？

  • birdfish (2014-2-10 21:33:29)

    我做的也是20kD左右的蛋白，湿转100v，30min，转膜后的胶考染基本没有条带，ECL发光可以看见微弱的条带。也不知道为什么，我提的蛋白跑胶后考马斯亮蓝染色35kD以下的条带颜色很淡，量很少，是降解了呢，还是本来小分子的蛋白量就少呢？

  • mingming0638 (2014-2-10 21:34:03)


    1. 可以考虑用两层膜, 我的转移条件是15V，30分钟（电流大概为110mA），检测蛋白为28kd。
    2. 你的目的蛋白样品纯吗？或者可以买到纯的目的蛋白吗？纯得话可以做一个dot blot, 检测一下抗体，也可以做一个梯度，观察一下检测下限，对你确定上样量有帮助。

  • zwsyrt (2014-2-10 21:35:01)


    电压确实太大了。不过不知道这样的话蛋白会怎样。胶没有化掉就好。
    我做histone的时候也是20k左右，一般16％，6×8cm2的胶用30mA左右转通宵，其实4个小时可能也够，但通宵可以保证上面也过去，有时候需要做内参。不过我们的那种机器应该不是湿转，不知道怎么叫。总之我也觉得应该增加转膜。

  • windboy (2014-2-10 21:35:28)

    楼上转膜条件能不能说清楚点，要转这么长时间，效果好吗？我转膜是电流一般是胶的面积乘以0.8mA,一般也大概30mA左右，但是按照你的条件还没有转过。

  • baidukk (2014-2-10 21:35:50)


    你好，我也是新手。我们实验室转膜时间一般是按分子量加5-6分钟时间算的。我的是23kd，一般就转29分钟，marker都能转上。电流=40mA。就是膜的面积×0.25。我们都是裁2×8cm的膜。如果同时转两块膜，就是80mA.
    希望对你有所帮助。

  • veiwu (2014-2-10 21:36:24)

    先确定跑完胶上是否有条带，若20kd左右处有条带再转膜，要有非特异条带的话抗体应该没问题
    实验室条件都不太一样，我们跑胶分别是60v.90v，转膜是250mA（湿转）
    分离胶不能压成一条线的话是ph问题

  • windboy (2014-2-10 21:36:43)


    谢谢大家，我用的六一的电泳槽，是老式的，玻璃板子大。按照恒压浓缩胶100v,分离胶120v,总个时间要3到4个小时。虽然时间长也不得不试试了，今天转膜了50分钟，26mA.用丽春红染色还能看到蛋白条带，但是还是不是很明显，因为，胶上的MARK还剩余没有转上来，是不是转的时间不够？等明天的结果了，如果不行在加点时间。

  • yychen (2014-2-10 21:37:03)

    我的也是六一电泳仪，胶的厚度是1.5mm的

  • windboy (2014-2-10 21:37:24)

    QUOTE:

    原帖由 yychen 于 2014-2-10 21:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
    我的也是六一电泳仪，胶的厚度是1.5mm的
    我胶厚度也是1.5mm，请问你20KD的蛋白电泳多长时间，浓缩胶和分离胶电压分别是多少？能不能介绍你们成功的方法和经验，谢

  • cwcwcww (2014-2-10 21:37:44)

    上样太多，电压太大……
    另外12%的胶，100V足够了，足够分离42KD的actin和20KD条带
    我半干转移电流都是按照膜，1mA/cm2
    我2年前做过组织的western，记得我只上样20uL，好像是帮人家测的VEGF

  • sunshine039 (2014-2-10 21:38:43)


    你加样量太多了所以分离胶才会扩散
    还有电压太高了，我做的是250KD的蛋白，用的电压差不多是你的一半
    你封闭的时间是不是短了点啊，一般都要37度封闭3，4个小时或4度过夜的，你是在什么温度下封闭的呀？封闭不好的话非特异性条带会比较多，不知道你有没有这个问题呢？

  • yychen (2014-2-10 21:39:06)


    电泳时间是根据marker来定
    目的蛋白大约在分离胶的中下1/3处停止电泳
    积层胶60v分离胶90v

  • taoshengyijiu (2014-2-10 21:39:47)

    一般情况下是你的转膜缓冲液不合适,以前我遇到过,用另外一种转移缓冲液什么都做不出来,换了一种很漂亮,而且梯度很明

  • zhihui小新 (2014-2-10 21:40:17)


    你做的是什么蛋白？看了你说的这些我觉得现在和你转膜已经没有关系。有些蛋白例如磷酸化蛋白不能用脱脂奶粉，可以改用BSA等

  • windboy (2014-2-10 21:41:12)


    谢谢大家，我做的是４Ｅ－ＢＰ１蛋白和其磷酸化的蛋白，分子量２０ＫＤ左右，做了免疫组化，表达在胞浆为主，表达量很多．我提的蛋白，是用碧远天的ＲＩＰＡ裂解液，有人说裂解液太强会把自己的蛋白抗原性去掉了，导致一抗结合蛋白的能力减弱，大家有没有做这个蛋白的，你们用什么裂解液啊？
    还有我用的是六一的电泳槽，大玻璃板，所以按照浓缩胶１００Ｖ，分离胶１２０Ｖ，总个时间三小时．时间很长．以前师姐他们用１８０Ｖ，和２００Ｖ一个半小时．
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