【求助】请高手帮忙分析一下Western结果不理想的原因

最新回复

• panda王 (2014-2-10 22:40:17)

  
  我个人觉得是否由一下几种可能性。
  1. 样品的处理
  2. 上样的浓度
  3.一抗 二抗的稀释度
  4.膜的背景显得有点脏，封闭效果也是需要考虑的问题之一

• toy (2014-2-10 22:40:44)

  
  脱尾，练成一片，减少上样量试试

• zhihui小新 (2014-2-10 22:41:04)

  
  拖尾一般是由于蛋白的问题造成的
  建议：在蛋白里加入适量10%SDS(比如30%)，
  其他正常，试试吧
  祝顺利

• damingxia0904 (2014-2-10 22:41:30)

  
  蛋白的处理，封闭的问题也要考虑一下。

• 33号 (2014-2-10 22:41:53)

  
  受体的WESTERN比较难做，有些文献直接提取膜蛋白做，效果还不错，只是内参设置麻烦点。除了2楼所述可能原因以外，个人经验裂解液的选择也很重要，你可以试试。

• flyxx05 (2014-2-10 22:42:39)

  考虑到七次跨膜的蛋白会有很多的疏水区，这对电泳会有什么影响？

• flyxx05 (2014-2-10 22:43:08)

  
  请问：哪种裂解液提取膜蛋白的效果较好？

• flyxx05 (2014-2-10 22:43:24)

  我觉得不是上样量的问题，因为这种方法我也试过，结果没太大的区别

• flyxx05 (2014-2-10 22:43:55)

  
  忘了说一下，我是从消化组织中提取蛋白

• xevin (2014-2-10 22:44:13)

  你用哪种RIPA来提取膜蛋白的？我刚刚准备提取膜蛋白。谢谢

• BUK (2014-2-10 22:44:44)

  不是说哪种裂解液好就能做出漂亮的条带，如果这样的话就用不着这么多种裂解方法了，这跟你提取的组织细胞和抗体有关，所以你要多试几种（如果有时间）。另外有时候你提取过程中的操作方法也很重要，比如是否新鲜组织匀浆，是否经过超声处理，等等。不知楼主用的是哪个公司的抗体，最好是多查查文献，看人家怎么做的，哪种抗体口碑不错（也就是用的多的），这样做起来更有底。

• BUK (2014-2-10 22:45:06)

  我想楼主的蛋白既然能出actin那很可能是提取的总蛋白。关于怎样提取膜蛋白，应该有很多方法，好像有的需要梯度离心，（不好意思，我也没做过），有些公司还出这种试剂盒，你可以查下有关书籍。
  实验这种东西不会那么一帆风顺，有点曲折是难免的，但当你取得自己满意的结果时那是一种难以形容的幸福，所以坚持……

• flyxx05 (2014-2-10 22:45:47)

  请教，你用哪种RIPA来提取膜蛋白的？我刚刚准备提取膜蛋白。谢谢
  
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  我用的是50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1% Triton x-100、1%脱氧胆酸钠、0.1% SDS。提的是总蛋白，
  但效果不好

• flyxx05 (2014-2-10 22:46:14)

  
  我提取的是总蛋白，而我的目的蛋白是膜蛋白，所以做的效果很差
  不知有没有直接从组织中提取膜蛋白的方法？