【求助】wb中遇到的一些问题

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-2-12 10:18 作者: Ao7 来源: 分析测试百科网

首先谢谢大家给予帮助了，
最近在做wb时遇到一些问题，过程叙述如下：
目的蛋白主要是一些细胞周期蛋白，如CDK-4, 分子量都在30kd左右，内参为beta－actin，浓缩胶5％，分离胶为12％，稳流15mA约一个半小时，电转为湿转，15V约半小时（做过30min到2H的，可能湿转效率太高了，只有30min左右胶上有少量蛋白残留），封闭液为含1％BSA的TBST，室温封闭1小时，一抗4度过夜，一抗1：1000稀释（根据说明书上推荐浓度，beta－actin一抗为1：200稀释）。TBST清洗两次，每次10分钟，再用TBS洗一次，10分钟，二抗室温孵育1小时，二抗为1：2000稀释（说明书推荐），TBST清洗两次，每次10分钟，再用TBS洗一次，10分钟，ECL显色，无条带，但根据清洗条件有不同背景。
结果：
无目的蛋白条带，甚至beta－actin也无条带，做过其他蛋白检测，也为30kd左右蛋白，结果良好。
问题：
1.样品问题？样品是经过loading buffer煮沸，4度保存的，该条件下目的蛋白可能降解吗？目的蛋白为细胞周期蛋白，被酶类降解？煮沸了不失活？
2. 电转条件如何选择？预染marker从30min到2h都可以顺利转移到膜上。电转液中有一定浓度的sds（0.37g/1L), 是否有影响，另外，我用0.22um的pvdf膜是否可能造成我的目的条带无法进入进而附着在膜上？(这种附着是结合吗？）
3. 稀释抗体用TBST还是用含1％BSA的TBST？Tween可以影响蛋白之间的相互作用，是否可能存在在孵育，封闭，漂洗过程中对实验结果造成影响？不考虑背景，我就是想做出来一次。
P.S. 抗体为刚刚购买的试剂盒中的抗体，应该没有问题。ECL本身也经过验证，没有问题。
有点乱，希望大家帮忙分析，求教了。

[ 本帖最后由 Ao7 于 2014-2-12 16:08 编辑 ]

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flower-201 (2014-2-12 10:18:48)

1、样品4度保存了多久了？如果说短期的话，4度应该没问题，但是长期保存的话，最好放负20或负80，另外，提蛋白时有没有加入蛋白酶抑制剂。
2、我们一般用湿转，NC膜，你可以试试90v一个至一个半小时，应该没有问题。
3、稀释抗体直接用TBST就可以了。TWEEN的应该没有什么影响。
最后，一抗的浓度建议提高，说明书上的浓度根据我们的经验，一般直接翻番还差不多。
Ao7 (2014-2-12 10:19:06)

谢谢楼上了,请问90V时大概多少电流？我15V时就有115mA的样子了，我看到的说明上是6－8V/cm电极距，根据自己的电泳槽选用15V跑。
另还有一个问题，我用的膜是0.22um孔径的pvdf膜，该膜是推荐转10kd以下蛋白的，而我做的目的蛋白为30kd，会不会有影响？是好的还是坏的？膜本身有正反吗？
66小飞侠 (2014-2-12 10:19:26)

我们一般是恒压转膜，有的也用恒流转膜，但是我发现恒流时电压变化比较大，有时候200mA电压是50v，有时候接近90v，所以恒流时电压多少不好说，可能跟transfer buffer有关。膜本身没有正反吧，至少我没注意到。
bring (2014-2-12 10:19:42)

1，可能转膜有问题，没有赚到PVDF膜上，可以转膜后考马染色看看，曝光以后丽春红染色。
2，可能一抗有问题，找个阳性蛋白做一下。你的actin没有显色，很大可能你的体系有问题，继续摸一下条件吧
Ao7 (2014-2-12 10:20:01)

谢谢各位了，关于转膜好以后的预染，我做过不可逆的考马斯亮蓝染色，是有条带的，而且透视法也可以看出条带，关于体系的验证，我做过一个28kd的蛋白，是有结果的，所以现在挺困惑的，今天又做了一次β－actin，换了一个一抗，希望有结果。个人感觉转膜才是最关键的步骤啊！！！
啊，还有，关于转膜的电压电流，个人感觉应该和仪器的功率和转移液是否新鲜配置有关，一般电流乘以电压看一下，新配的转移buffer在恒压下电流较小，而且恒压下，电流会有逐渐变小的趋势，不过我使用的仪器不明显。
Ao7 (2014-2-12 10:21:20)

对了，希望那位大虾可以回答一下这个问题，谢谢了。
我用的膜是0.22um孔径的pvdf膜，该膜是推荐转10kd以下蛋白的，而我做的目的蛋白为30kd，会不会有影响？是好的还是坏的？膜本身有正反吗？
windy+++ (2014-2-12 10:21:43)

请问－20度蛋白可以保存多久而不影响WB结果？
taoshengyijiu (2014-2-12 10:23:00)

一般的20KD以下的蛋白用0.22um的膜，20KD以上用0.45UM的膜。
taoshengyijiu (2014-2-12 10:23:25)

膜本身没有正反，孔径小肯定会影响结果的。我提的蛋白煮沸变性后在4度保存了1个小时，蛋白会不会降解？
plaa (2014-2-12 10:23:46)

QUOTE:
原帖由 taoshengyijiu 于 2014-2-12 10:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
膜本身没有正反，孔径小肯定会影响结果的。我提的蛋白煮沸变性后在4度保存了1个小时，蛋白会不会降解？
是否在上样缓冲液中煮沸？
taoshengyijiu (2014-2-12 10:24:07)

QUOTE:
原帖由 plaa 于 2014-2-12 10:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

是否在上样缓冲液中煮沸？

是啊是在上样缓冲液中煮沸！我用的电泳液比较旧了，两蛋白带之间间距很小，是不是给电泳液有关，还有一个问题就是，电泳后我的胶用考马斯亮蓝染色后，脱了一两天色才看到看到七条大的蛋白条带，但没有小的蛋白条带，是不是放在放的时间过久，小蛋白降解了？