【求助】Western 做不出来，请有经验的战友看看怎么回事

最新回复

• cj_mondy (2014-2-12 16:12:26)

  
  对了，我的浓缩胶是百分之４的，分离胶百分之１０的．请各位大侠千万指引一下，感谢．

• yjf1026 (2014-2-12 16:15:31)

  
  你在加一抗之前，有没有封闭？
  另外，结果令人失望，是指什么样的结果？条带呈什么趋势？

• cj_mondy (2014-2-12 16:15:56)

  
  封闭了,用百分之5的牛奶封闭2小时,结果是没有条带.
  对了我想问一下,转膜时膜是怎么放的?我们是带黑疙瘩的那一面上面放两层滤纸然后放胶,然后再放PVDF膜,最后再放两层滤纸.
  那个带红疙瘩的夹子上是这样的:红疙瘩的那一面上面放2滤纸--胶--PVDF膜--2滤纸.
  楼上的老师,不知道我们这样放的顺序对吗?很急,敬请老师多多指教.谢谢.

• xingyi08 (2014-2-12 16:16:42)

  
  关键是看正负极，一般红色是对正极，黑色对负极。正极--2滤纸--膜--胶--2滤纸--负极。

• abc816 (2014-2-12 16:17:00)

  没看懂你的描述，似乎你转膜时把正极和负极分成两份了？红色和黑色夹子应该是夹在一起的，顺序正如楼上战友所说。
  你用的是湿转还是半干转？
  要不你点样时加预染Marker,下次转膜后看看Marker有没有转到膜上。

• BOSS2011 (2014-2-12 16:17:17)

  
  1. 一抗是辣根酶标记的，这样不用二抗的方法 敏感性低一些。为什么不用常规的一抗孵育后，结合HRP标记的二抗的方法？
  2. 5%奶粉2h封闭，改成3％的奶粉封闭0.5h。我们实验室基本都是用3％的奶粉封闭0.5h。如果背景很深的情况下，采用5％。
  3. 加大上样量。第一次做的时候做个蛋白梯度。找一个合适的蛋白上样量。
  4.转膜的时候，记住是从负极向正极转。加一个彩虹marker，检测转膜效率。
  5.多练习。
  祝你 成功

• cj_mondy (2014-2-12 16:17:38)

  老师,我们转膜每次膜上都有marker的,说明我们的转膜没问题是吧? 今天我们又作了一次BSA,结果我们在胶上染色BSA很明显,而我们的目的蛋白几乎没有,这是不是说明我们的蛋白浓度太低了?还是根本没提出来?老师,速回.
  最后,你能不能讲一下你们实验室组织提蛋白的方法?十分感谢.

• glass (2014-2-12 16:18:19)

  
  转膜marker很清晰，而且BSA能够很好的转过去，说明转膜应该没有问题。
  那问题就应该是出在你的样品上。我也觉的可能是目的蛋白含量太低了。
  RIPA是最常用的组织裂解液，我们实验室都是自己配制，成分差不多。裂解液体中多加几种蛋白酶抑止剂，或者直接用cooktail。
  建议你重新匀浆，匀浆的时候可以按照1：4（组织重量/组织裂解液）比例匀浆。
  我也是新手 ^_^
  祝你 成功
  

• BOSS2011 (2014-2-12 16:18:44)

  
  明白WB的原理，问题就好解决了！

• avi317 (2014-2-12 16:19:07)

  
  首先要看你蛋白提出来了没，我提组织蛋白的步骤给你的差不多，但跑完胶后用考马斯亮蓝染色后只有两条大的蛋白片段，其它的空白一片，建议跑完电泳后先鉴定一下你的目的蛋白提出来没有。

• ritou1985 (2014-2-12 16:19:28)

  
  如果你的蛋白提出来了，是不是你的封闭液浓度太大或者封闭时间过长了呢？建议1%BSA封闭1h试一下。

• ending (2014-2-12 16:19:50)

  
  我也建议转完膜后用立春红染一下，看具体是转膜还是孵育有问题。
  有一些抗体要求必须用BSA封闭，你查一下抗体说明书

• flower-201 (2014-2-12 16:20:06)

  
  为什么不先做内参呢？
  内参比较好做，做出来内参说明你的WB体系没有问题，后面就摸索一抗二抗浓度，还有就是你的目的蛋白的表达量。
  建议先做内参吧。

• am10 (2014-2-12 16:20:57)

  
  各位高手，wb做不出来目的条带，考虑是组织中目的蛋白浓度低了，怎么提高蛋白浓度？超滤浓缩吗？