【求助】表达出蛋白

最新回复

• one (2014-2-12 19:32:48)

  
  http://www.genomex.com/vector_maps/pBadTopo_map.pdf
  是这个载体吗？
  如果你把后面的his tag也加上了，不考虑别的因素（如signal peptide等）的话，表达出来的蛋白应该比目的蛋白大6 kD左右。不知道您是否把这个考虑进去了。
  ”大小比预测蛋白大了20KDa“。
  您的蛋白多大？如果是20 kD，可能是dimer；如果是200 kD，可能就是SDS-PAGE的精确度；所以这个信息对于判断也是很重要的
  电泳的异常行为，蛋白版有过很多精彩的讨论，您可以搜索看看。
  如果花过多的时间去做这个工作，建议送去做一个MS identification。

• yyaxw84 (2014-2-12 19:33:21)

  非常感谢版主,我用的是pBAD/giii/A载体,已经考虑加进6KDa了,加进去蛋白大小应该为62KDa,我曾经用5XSDS buffer当作1x,2x用就是怕产生dimer,但结果还是一样

• gogo (2014-2-12 19:33:53)

  
  那可能你的蛋白里疏水性氨基酸比较多啊!跑的偏大啊!
  你可western鉴定和纯化一下,看能否纯化出来

• yyaxw84 (2014-2-12 19:35:40)

  请教一下,为什么疏水性氨基酸多,就会偏大,而且较62KDa大了20KDa

• dongdongqiang (2014-2-12 19:36:18)

  
  蛋白电泳有很多与表观分子量不一致的例子。
  比如Histone，很多Arginine和Histidine，电泳的时候表观分子量偏大（～20 vs 33）；有些Proline丰富的蛋白也有这种现象。
  疏水性氨基酸？可能会导致与SDS 结合的比例。这样一来电泳率可能会变化，因为电泳速度主要取决于SDS的电荷（比）；
  然后就是你用的什么marker？是预染的还是未预染的？用的什么方法plot你的分子量？
  还有的蛋白结合了一些物质，比如有的膜蛋白，在电泳前用EDTA处理以去掉脂多糖，否则分子量也不准的。
  再罗嗦一句，有疑问时，MS是王道。否则最终人家问这个问题时你总是没有直接的证据。

• tangxin_80 (2014-2-12 19:36:40)

  我的也有这个问题.原核表达蛋白比预计的大了10kD,但是western和Ni+柱纯化都很正常.用该纯化的蛋白制备多克窿抗体检测组织中该蛋白的表达,发现主带的位置同样大了10kD.现在不知道怎么解释这个问题

• #甜# (2014-2-12 19:37:01)

  
  有没有考虑在细菌中存在翻译后修饰啊？

• yyaxw84 (2014-2-12 19:37:21)

  
  原核表达存在翻译后修饰吗?老师说我这个蛋白碱性氨基酸含量多了些,结合SDS后会不会含负电荷要比其他普通蛋白要少些,影响了泳动率

• nvdabing (2014-2-12 19:38:03)

  我也和你有同样的现象，请问你最后怎么解决的？现在问题处理好了吗？

• am10 (2014-2-12 19:38:46)

  
  现在还没有解决,但我准备纯化后做个MS分析一下,因为我用了两种抗体做一抗做western-blot鉴定都正确.

• greenbee (2014-2-12 19:39:08)

  
  没必要解决把，正如楼上所说： MS是王道。 有MS数据，SDS的数据也就是解释一下就行了

• mimili_901 (2014-2-12 19:39:35)

  
  弱问一句什么是MS,谢了

• 大海啊故乡 (2014-2-12 19:40:02)

  QUOTE:

  原帖由 mimili_901 于 2014-2-12 19:39 发表
  
  弱问一句什么是MS,谢了

  ms是质谱

• wiwi (2014-2-12 19:40:28)

  现在还没有解决,但我准备纯化后做个MS分析一下,因为我用了两种抗体做一抗做western-blot鉴定都正确.
  
  =============================================================================================================
  
  如果做MS，没必要纯化。SDS PAGE的样品（目的带还是要分的很干净，与别的带分开），用干净的小刀切下来后即可。注意整个过程带手套。