【求助】线粒体蛋白质组学问题：提取足够量的蛋白需要...

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• ha111 (2014-2-13 14:53:49)

  
  肝脏线粒体很丰富，大概 1000–2000个／细胞，占细胞的总体积的1/5。HeLa细胞肯定比肝脏线粒体少多了。
  This paper estimated the number of "virtual" mitochondria (see below) in cells
  from 5 different cell lines, which were derived from rat (skeletal muscle),
  mouse (fibroblast), rabbit (2 types of macrophage), and human (fibroblast).
  They found that the rat skeletal muscle cells had on average 140 "virtual"
  mitochondria. The overall counts ranged from ~90 mitochondria per cell in
  one type of rabbit macrophage to ~700 in the other type of macrophage.

• hold住 (2014-2-13 14:57:43)

  
  线粒体数量和组织类型有很大关系，肝脏里面的线粒体很丰富，所以提取不困难，但是hela细胞可能就少的多，一般来说，培养细胞中提取线粒体大约至少需要2*107以上的细胞，也只能得到很少的一点线粒体，而这点线粒体中蛋白的含量也不是很高，所以需要反复提取，直至得到所需要的线粒体蛋白量，工作量比较大。

• abc816 (2014-2-13 14:58:02)

  
  我以前也做过线粒体的样品，感觉提取出来的蛋白很少很少，后来就先裂解细胞，裂解液不能多。先在一个盘上涂300ul的裂解液，裂解细胞，然后收集样品，再涂到另一个盘上裂解细胞，大概5个盘收集一次，换新的裂解液。收集到的样品差速离心后，用5k的超滤膜浓缩，这个膜Millipore生产的，样子很像离心管，可以将样品浓缩到20ul。再进行后面的试验就容易了。

• 莲花白 (2014-2-13 14:58:24)

  我液碰到了同样的困惑,我是想提取乳腺癌细胞MCF-adr的线粒体 蛋白来做Western,已经买了pierce的线粒体分离试剂盒.我想请问那位有经验的战友至少需要多少细胞才能保证上样量充足啊?另外裂解液有什么特别的要求吗?用碧云天的RIPA可以吗?

• 49888 (2014-2-13 15:01:59)

  
  你的实验PROTOCOL也有一定问题，匀浆不够充分。
  再者，不知道你取线粒体粗提物时的差速离心力是多少？
  按照我的经验10*8次幂最后就可以得到大约400mg的线粒体。

• 49888 (2014-2-13 15:02:33)

  对了，忘了提一下，10的8次幂也就是10盘10cm的dish长满就可以了