【求助】免疫共沉淀问题

最新回复

• remenb (2014-2-13 16:28:07)

  
  你好，我也想做免疫共沉淀，能不能把你的protocol及你的结果图片给我一份？
  谢谢

• guagua (2014-2-13 16:30:28)

  1.细胞的状态。也许你的目的蛋白的表达和细胞的生长状态有关，比如是否confluence诱导的。
  2.操作：严格低温了么？时出时不出，可能和你的操作有关，也许有些时候动作比较麻利，温度控制的好。
  3.蛋白酶抑制剂：加全了么？不会失效吧？目的蛋白如果降解了，还IP什么劲啊。

• 白白的 (2014-2-13 16:38:09)

  
  有时有，有时无，这里面首先一个问题是你做ＩＰ时是不是每次的实验条件都相对一致？细胞状态，c ell lysis每次都是新鲜裂解的还是冻存的？每次操作条件是否一致？比如冼的数和用的洗涤液是一样的吗？ＩＢ的抗体效能有无变化，如果每次的实验条件都保持一致，还是这样，那可能你的protein interaction是可记诱导的

• PINK (2014-2-13 16:38:39)

  请问免疫共沉淀后的分子片断如何判定？

• 3648755 (2014-2-13 16:39:03)

  
  IP最重要一点就是做好阴性对照，若有若无时，如有可能做好阳性对照，说明你的体系是否存在问题的。
  你做的IP是过表达还是内源性的，若是过表达，可以换一下标签再重新做一下。内源性可能就是需要认真考虑了，IP的二种蛋白在细胞内的表达丰度如何？最好是选用均是高表达的细胞系。
  回复楼上，IP后的分子片段可以采用质谱来鉴定

• wmp1234 (2014-2-13 16:39:28)

  我想用HA-tag做IP,请问我是用多抗好还是单抗好呢?

• ero11 (2014-2-13 16:40:48)

  
  平时所用的感觉哪种抗体较好呀，HA标签抗体，应是单抗吧，我用的是单抗，事实上抗体的关系不是很大，如果真有相互作用的话，什么抗体也检测出来，若没有，好的抗体也没有必要

• wmp1234 (2014-2-13 16:41:14)

  IP最重要一点就是做好阴性对照，若有若无时，如有可能做好阳性对照，说明你的体系是否存在问题的。
  你做的IP是过表达还是内源性的，若是过表达，可以换一下标签再重新做一下。内源性可能就是需要认真考虑了，IP的二种蛋白在细胞内的表达丰度如何？最好是选用均是高表达的细胞系。
  
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  请问阴性对照该怎么做？
  不加蛋白样品？

• ritou1985 (2014-2-13 16:42:12)

  
  阴性对照不是不加蛋白，而应该是加一种跟你做IP时加的抗体同源的IgG，其它操作一样

• 33号 (2014-2-13 16:42:31)

  
  阴性对照加的量应该怎么确定呢？