【求助】蛋白变性后放-80°会不会完全坏了？

最新回复

• am10 (2014-2-15 15:16:40)

  没坏。
  可能是有部分蛋白沉淀，导致蛋白浓度降低，最终上样量减少。
  重新转膜吧！用第一个条件。100min太短了！想节省时间的话可以加大电流，比如用60V，1.5h。
  over

• 30moonriver (2014-2-15 15:17:34)

  我还有两个问题：
  1 蛋白这样加Loading buffe并煮沸变性后保存于-80°好不好啊？煮沸是什么作用？
  2 以前看帖子有不少人说蛋白上样前要离心沉淀是为什么？像我这样情况是我该上样前离心还是摇动使沉淀浮起呢？

• H2O (2014-2-15 15:18:09)

  1
  低温保存当然是好的，这样可以最大限度地避免酶解和细菌等的污染。煮沸的作用以前园子里有人回答过，我搜出来了一条：是使蛋白变性，使SDS与蛋白按比例结合；同时也可使DNA变性。加热只会破坏二硫键，而不会破坏蛋白质的一级结构，WB主要就是测蛋白的表达含量以及分子量。因此煮沸不会破坏多聚体的一级结构，也就不会影响用WB来检测；
  2
  要知道你两次做的实验，不仅样品不同，连转膜的时间也变了。所以说可能是蛋白的原因也可能只是转膜的时间过短而已。电泳前用枪头吸出管低的蛋白，电泳后考马斯亮蓝染色，如果在加样孔附近有蓝色的颗粒状物质，就说明有蛋白沉淀。蛋白沉淀容易，再溶解就难了，具体方法你再搜下园子吧，我也不是很清楚。
  祝你实验顺利！~~

• wmp1234 (2014-2-15 15:18:45)

  加热只会破坏二硫键，而不会破坏蛋白质的一级结构
  
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  补充一下,只有加入还原剂才会破坏二硫键,加热不会破坏二硫键。

• BOSS2011 (2014-2-15 15:19:17)

  2 以前看帖子有不少人说蛋白上样前要离心沉淀是为什么？像我这样情况是我该上样前离心还是摇动使沉淀浮起呢？
  
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  一家之言。
  蛋白上样前离心的一个目的是除去不溶物，因为不溶物的存在会影响电泳效果。上样前应离心弃沉淀而不是使沉淀浮起。
  

• 30moonriver (2014-2-15 15:20:08)

  
  首先,谢过大家的热心相助。
  1 可否上样前再煮沸几分钟促使沉淀的蛋白溶解，然后离心，去除沉淀的杂志？
  2昨天用原来用剩的蛋白和这次的做了个对照，各加了三个孔，发光后的确是新的蛋白连一点光也没有，而原来的蛋白是有条带的，这样子是否可以推测是蛋白出问题了？如果是这样的话，除去负70冻存的原因，还有那些坏节可以造成蛋白破坏呢？因为上次的蛋白和这次的是从一个EP管分装的，一样的 Loading buffer ,区别就在保存方式。
  3我用新的蛋白电泳时发现加样孔越到分离胶就越弥散，至溴酚兰快到胶底时简直就成了一个差不多1cm 粗的波浪线，非常难看。但是maker和单加的loading buffer孔都没问题。这个是不是说明我的loading buffer出问题了？因为配胶用的东西都是前几天还用的好好的。

• 莲花白 (2014-2-15 15:20:28)

  
  会不会是断裂的二硫键又有部分连上了呢？你重新加点DTT处理下呢