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【求助】2-D蛋白样品的处理

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-2-15 15:21 作者: eve_49 来源: 分析测试百科网

用肿瘤细胞系做给药前后的蛋白表达变化，银染后发现有一些横向条纹，应该是样品中盐浓度比较高，想请教一下除了用试剂盒以外还有什么比较简单经济的方法可以除盐。
另外如果想用考马斯亮兰染色要求的蛋白浓度比较高，我用13cm胶条上样量是250ul，我的蛋白浓度大概8ug/ul，要是加样时rehydration Solution加得少会不会对电泳有影响呢，需要浓缩蛋白吗？如果需要用哪一种方法比较好？

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【求助】2-D蛋白样品的处理

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DONT (2014-2-15 15:22:04)

楼主说的横向条纹不知道是那种情况，如果能发图上来的话更好判断，因为横条纹的产生并不只有盐浓度的影响，也有可能是受一向的水化时间不够，或者是聚焦的时候IPG胶条放置的影响导致聚焦不充分。
这里权当是盐浓度的影响，除盐的话用试剂盒那已经是在加裂解液之前的处理了，楼主目前既然只是银染后才发现了一些横向条纹而已（银染的灵敏度相当高），那我个人觉得考染以后，图像效果肯定会好些，横条纹不会那么多，如果还不满意，使用盐桥应该就能改善盐离子的影响了。
13CM的胶条上样总量250ul, 所以楼主用的应该是GE的瓷上样槽，一定要注意总量的控制，否则覆盖油溢出会对结果有影响，水化液加的少不用担心，应为裂解液的成分和水化液是基本一致的。 13CM的胶体金G250考染我们的上样量一般是250-300ug. 如果是R250和350, 可能要上多点。
eve_49 (2014-2-15 15:22:37)

这是我做出来的图，我是新手第一次做，没有经验，请大家帮我分析一下

23969932.snap.jpg
eve_49 (2014-2-15 15:22:57)

上图是对照，这个图是加药以后的

35962723.snap.jpg
DONT (2014-2-15 15:23:49)

给楼主的图上了点标记，逐一分析下：
A. 有很多横竖交错的条纹，说明楼主的平衡液或者用来封IPG胶条的琼脂糖溶液有杂质，最好新配（也有可能是加到里面的溴酚蓝的影响，因为我们实验室也出过类似的情况，溴酚蓝母液长菌引起类似情况，新配后解决）
B. 楼主的血清污染相当少，但是却在染色过程中有过饱和现象，猜测原因一是楼主使用的培养基是无血清的或者是添加营养成份的，原因二可能楼主做了去血清蛋白的KIT处理。
C. 此处是由第二向的SDS胶胶面不平从而使1，2向结合不紧密引起的，分离胶可以直接水压，浓缩胶推荐楼主用饱和正丁醇压，并且用钝物轻轻敲打玻璃使分界线水平。
D 楼主的指纹，可惜楼主没备案，不然可以输入公安局的网上系统查找出楼主的身份，o(∩_∩)o..
E. 这些点不是蛋白质，是楼主在染色过程中所配的溶液没完全溶解所致，所以滞留在胶表面在染色的时候留下了痕迹
至于胶图上的其他横条纹，不完全是盐离子的影响，更像是聚焦不充分引起的。冒昧的分析了这么多，希望对楼主有用。
P.S. 加药组的水不干净，胶都被污染了，其实推荐楼主用考染，效果可能会好些，也干净些，而且还能和质谱兼容。

50616849.snap.jpg
eve_49 (2014-2-15 15:24:20)

实验室里刚装了2－D的机器，懂得使用的人不多，有问题都不知从何解决。
封IPG胶条的琼脂糖溶液和加到里面的溴酚蓝我都是新配的，不过用的是去离子水没有过滤，应该没有影响吧？打算重新配平衡液，因为是别人给我的，不是自己配的，不清楚情况。
关于血清污染，我用的是含10％FBS的DMEM，也没有用kit处理过，为什么会出现过饱和现象呢？
配胶的时候胶面用异丙醇封的，但是可能我的台面不太平，我下次会留心。
关于指纹的问题，我也发现了，但是***作过程中一直戴乳胶手套呀，为什么还有指纹呢？另外冲洗胶用去离子水或者双蒸水就可以了吧？
IEF一直达不到8000v，就在7000多的位置波动，是不是因为我的蛋白样品没有经过任何去盐处理导致聚焦不充分呢？
huifeng0516 (2014-2-15 15:28:29)

呵呵，楼主跟我的情况差不多
我们实验室也是新进的2D，没有人会，就我一个人在摸索
最近做的比较郁闷，总是有横条纹，聚焦时间也已经很大了呀，到底是怎么回事呢？
林外楼主说的配胶时的封胶问题，我倒可以提供一个方法，用装满水的小喷壶喷水，通过水滴来压胶面，我做时都是采用这种方法，胶面还是很令人满意的
另外令楼主头痛的手印问题，我这也有个小窍门，您可以在去染色液时用保鲜膜压着胶，而不要直接用手碰，即使是戴着手套也不行，因为银染实在是太灵敏了
呵呵一点小建议，希望能对楼主有用：）
sunnyB (2014-2-15 15:28:50)

保鲜膜压胶是好办法，好像不用乳胶手套，用普通的塑料薄膜手套也可以去掉手印。
yonger (2014-2-15 15:31:09)

染色倒液体的时候建议用灌胶模具中的塑料隔片压着，既有弹性又有支持作用。
gogo (2014-2-15 15:31:55)

塑料薄膜手套
完全可以解决这个问题！！！！
把手五指张开，用力压住，别怕，我们的胶还是很结实的，不怕压就怕折！！
wmp1234 (2014-2-15 15:34:11)

在我们实验室压胶用饱和的正丁醇，效果很好。
wmp1234 (2014-2-15 15:34:42)

可以做一个塑料透明的方形盒子，在底边上开个口，用乳胶头封住，染的时候倒液体可以拔开乳胶头，倒掉液体，那就不必接触手，我们实验室就是这么做的。