【求助】western 转膜-预染marker转移不全

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-2-15 15:35 作者: u234 来源: 分析测试百科网

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【求助】western 转膜-预染marker转移不全

请教：做western 时用的Formatas的预染marker,Millipore PVDF 膜，转膜后可见75KD以上的大分子量的marker，但是看不到小分子量的marker，转膜条件:湿转，恒流自80-300mA，1-4小时都试过了.在胶上还可见少量大分子量的marker时，不论是凝胶还是膜上均不见75KD以下的小分子量的marker。延长转膜时间大分子量的marker均转至膜上，仍不见小分子量的marker。
转移缓冲液配方：Tris 5.8g,甘氨酸2.9g,SDS0.37g,甲醇200ml，加水至1L。
先谢谢大家！

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最新回复

wmp1234 (2014-2-15 15:35:59)

转印缓冲液中的SDS去掉试试
SDS可能影响小分子蛋白转膜
u234 (2014-2-15 15:36:15)

多谢！明天我再试一下。今天用NC膜和PVDF膜同时做，条件相同，NC膜maker全部转移至膜上，PVDF膜仍然部分转移，且与NC膜比较，marker 颜色较浅。不知是何原因。
莲花白 (2014-2-15 15:38:55)

你的ｐｖｄｆ膜孔径是０．４５的还是０．２的？
04906 (2014-2-15 15:40:16)

0.45.
ritou1985 (2014-2-15 15:41:21)

不知道你是怎么理解转膜的？
在SDS-PADE凝胶中，蛋白运动的速度由分子量和电场强度决定。分子量越大运动越慢，反之越快。电场强度越大，速度越快，反之越慢。
你也发现凝胶和膜上都没有小分子量预染marker，那就说明小分子量的蛋白已经从凝胶中出来，但又没在膜上——肯定是转过了，都跑到转移缓冲液里面去了！那么就应该减少转移时间，怎么会想起要去延长呢？岂不是转过的更多吗？
你做的目的蛋白是多大分子量的啊？如果在20KD以下，强烈建议用0.22（0.2um？）um孔径的膜。如果是30kD以上，可以用0.45um孔径的。可同时用两张膜重叠在一起，即便有蛋白穿过第一张膜，也会被第二张拦住的。
u234 (2014-2-15 15:41:51)

QUOTE:
原帖由 ritou1985 于 2014-2-15 15:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
不知道你是怎么理解转膜的？
在SDS-PADE凝胶中，蛋白运动的速度由分子量和电场强度决定。分子量越大运动越慢，反之越快。电场强度越大，速度越快，反之越慢。
你也发现凝胶和膜上都没有小分子量预染marker，那就说明小分子量的蛋 ...
谢谢！我同意您的看法，因为我的目的蛋白有两个25KD和110KD，内参42KD,当时延长时间是为了看110KD的转膜时间；但无论如何Marker也应该有的吧，而且做了对照，NC膜效果很好。若“同时用两张膜重叠在一起，即便有蛋白穿过第一张膜，也会被第二张拦住的”，若两张膜上都有，以下的步骤如何进行？两张膜都曝光？这样可以么？
mamamiya (2014-2-15 15:42:08)

我们原先一块儿做过实验：
1
所谓的marker并不是什么特别的东西，只是已知分子量的几种蛋白的混合物，有些在上面已经用染料做了标记，有的没有。也就是说它具有蛋白共同具有的性质，自然也可以转过了；
2
你的两个目的蛋白分子量相差过大，建议电泳后将凝胶在110KD和42KD之间小心切成两块，两块胶分别同时转印，小分子量的转印时间短些，大分子量的时间长些。这种方法简便易行，也是允许使用的。
3
可以把两张膜都孵育一下。也可以根据两张膜上的marker颜色深浅来决定选择哪一张：在你的目的蛋白附近的marker颜色更深的，也就是更可能出现阳性结果的膜。
祝你实验顺利！~~
u234 (2014-2-15 17:18:54)

今天用PVDF膜0.45试了下，转移液中去掉SDS，110mA 1h,结果膜上可见Marker的所有条带，同时滤纸上也有模糊的条带，估计是转的时间长了或是电流大了，遂决定明天用NC膜和PVDF膜减小电流或缩短时间再试一下不知是否可行。