【求助】如何提取高浓度的蛋白

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-2-15 22:29 作者: coolcool 来源: 分析测试百科网

我每次提取的蛋白BCA测大概1200ug/ml,
这样算每孔最多加20uL，除去Loading buffer（我的是5*的）,就只有20ug的蛋白，
我的目的蛋白表达低，想要加多蛋白，
如何才能提高提取总浓度，以在上样量有限情况下，加多量蛋白？
是不是可以加少一点裂解液？会不会细胞太多裂解不了？
但说明书说150uL/孔（6孔板）裂解100万个细胞，难道是提取以后有方法浓缩？
请指点，多谢了

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【求助】如何提取高浓度的蛋白

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#问号# (2014-2-15 22:34:22)

你如果只是定性的话，可以同时培养几瓶细胞，提蛋白时候先用胰酶将细胞消化，然后离心，取细胞沉淀，最后直接加细胞裂解液进去，后面操作一样
你试试这个方法看是否可以？
coolcool (2014-2-15 22:34:39)

你的意思就是加多点细胞用同样量的裂解液？
我想知道150uL的RIPA可裂解远远大于100万细胞的量吗？就是5、6百万的细胞？
vcve (2014-2-15 22:34:58)

1.RIPA裂解液的量要你自己控制。6孔板的细胞一般的裂解液加30ul也没多大问题，主要是RIPA会裂核的，如果量太少会很黏稠，吸不起来。不过如果你的目的蛋白是胞浆蛋白，我推荐用普通的裂解液，6孔板加个50ul就可以了，这样浓度就提高了一倍。
2.如果条件可以的话，建议换1.5的板子，上样量可以上到45ul+，不过就算1.0的板子我也上过30ul的啊
3.如果实在上不进去，就把堆积胶稍稍做长一点，然后加20ul样，跑一会，压进堆积胶以后再上20ul，在堆积胶里蛋白们会追到一起的，放心。
但愿可以帮你解决这个问题。
fqswdzd (2014-2-15 22:35:15)

可以将蛋白冻成冰后置于冻干机内干燥一段时间。自己掌握
cbou876 (2014-2-15 22:36:34)

超滤.
gogo (2014-2-15 22:36:53)

延长冰上裂解时间，增加裂解次数。
有超声的话，超声破碎，效果很好。
coolcool (2014-2-15 22:37:10)

我用150uLRIPA 裂了400万个细胞，貌似都裂完全了，BCA测有3000-4000ug,希望有结果，先谢谢大家
dreaming (2014-2-15 22:37:56)

提取的溶液蛋白浓度不够，为什么只是想在提取的时候将蛋白浓度增加，而不是进行浓缩呢？菜鸟学习中，请指点！
guagua (2014-2-15 22:38:14)

因为如果在提取过程中增加浓度（减少裂解液），是个减少成本的过程
而如果提个稀的蛋白，再去冻干什么的，是个增加成本的过程