【求助】大分子量的膜蛋白WB求助

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-2-19 10:13 作者: BOSS2011 来源: 分析测试百科网

一个暑假都在做这两种膜蛋白一种170KD，一种190KD。一直没有条带。做过以下条件的，
12 %分离胶，50MA，6H, 5%脱脂奶粉过夜，一抗1：100 ，1：200，1：500（santa）过夜。TTBS三次每次10min,二抗 1：2000 TTBS三次每次10minECL发光。
6%分离胶，300ma，2.5h, 5%脱脂奶粉过夜，一抗1：100 TTBS三次每次10min,二抗 1：2000 TTBS洗三次每次10min ECL发光
一直没有结果，各位高手请帮帮我。
膜蛋白体提取时候要注意什么？我是用的细胞刮

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【求助】大分子量的膜蛋白WB求助

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am10 (2014-2-19 10:14:57)

QUOTE:
原帖由 BOSS2011 于 2014-2-19 10:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
一个暑假都在做这两种膜蛋白一种170KD，一种190KD。一直没有条带。做过以下条件的，
12 %分离胶，50MA，6H, 5%脱脂奶粉过夜，一抗1：100 ，1：200，1：500（santa）过夜。TTBS三次每次10min,二抗 1：2000 TTBS三次每次10minECL发光。
6%分离胶 ...
你的转膜条件是什么？
duoduo (2014-2-19 10:15:29)

电泳后有没有考兰染色，有没有条带？
BOSS2011 (2014-2-19 10:29:11)

QUOTE:
原帖由 am10 于 2014-2-19 10:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

你的转膜条件是什么？
是北京六一的湿转，最后用的是300MA，2.5小时。
ritou1985 (2014-2-19 10:29:43)

染一下转膜后的胶。若胶上、膜上都没有考虑转过了。你可以试一下200MA，2小时
wmp1234 (2014-2-19 10:30:17)

其实这么大分子量的蛋白的确不容易出结果，我在一些文献上看到的实验方法是，梯度变性胶。但是做这种胶需要特殊的仪器。
zhenxin (2014-2-19 10:31:01)

梯度变性胶怎么配？应该是没有转过，因为我的是预染marker，正面颜色很深，反面相对较浅。
各位膜蛋白提取有什么好的方法？
summerxx (2014-2-19 10:56:33)

先可以考虑转膜的问题，像楼上说的，转膜后考染一下
如果转膜没有问题，可以考虑你的蛋白，
因为是膜蛋白，在细胞裂解时，这些蛋白不容易被充分裂解
不容易溶于裂解液中。
这样可以先做个Dot-ELISA试试。
JK.jon (2014-2-19 10:56:52)

可以考虑用8%和10%的分离胶
BOSS2011 (2014-2-19 10:57:14)

谢谢各位，觉得还是蛋白提取的问题，新买了个膜蛋白提取试剂盒打算再试试
小糖块 (2014-2-19 10:57:43)

请问各位高手，我是搞抗菌肽方向的，即将开题，现我们课题组已分离出几种多肽，其中一种已测序经比对无同源性，老板可能让沿着做下去，例如，基因工程，基因定点突变技术。。本人才浅，不知该如何想与做，诚请前辈指点，不胜感激！