【求助】酵母表达zeocin筛选问题！

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-2-19 11:02 作者: qqq111 来源: 分析测试百科网

各位做毕赤酵母的xdjm，俺在电转化后采用 zeocin（200ug/ml）进行筛选，结果不到两天时间长成一片，无法挑取单菌落，随机划线挑取混合菌落进行诱导，结果没有蛋白表达，已经多次出现这种情况，不知是何原因。以前曾经用过500ug/ml的浓度，虽然长出几个单菌落，虽然长的慢点（大约三四天）但是诱导后没有蛋白表达，亦不知道原因。急切盼望各位高人予以指点，急！

查看完整版本请点击这里：
【求助】酵母表达zeocin筛选问题！

我也来说两句查看全部回复

最新回复

mimili_901 (2014-2-19 11:08:51)

请问您制作zeocin平板的过程？
高压灭菌之后，待温度降低，才能将抗生素加入，以免太高温度让zeocin失活。
glass (2014-2-19 11:09:14)

QUOTE:
原帖由 qqq111 于 2014-2-19 11:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

各位做毕赤酵母的xdjm，俺在电转化后采用 zeocin（200ug/ml）进行筛选，结果不到两天时间长成一片，无法挑取单菌落，随机划线挑取混合菌落进行诱导，结果没有蛋白表达，已经多次出现这种情况，不知是何原因。以前曾经用过500ug/ml的浓 ...
200浓度长很多，500长几个，说明抗生素添加是有问题，就像楼上说的那样，添加时温度是不是合适？
第二个问题，没有表达有很多原因，鉴定是否做过，诱导方法具体是什么呢？
蛋白板块有两个这方面的精华帖可以参考一下。
我个人的一点教训就是：诱导前菌体密度不够，导致表达量超低，按照手册的方法进行诱导，提高诱导前的密度，就诱导出目的蛋白表达了，当然我先前已经用其他方法验证过重组子了！

92939449.snap.jpg
bring (2014-2-19 11:10:06)

我是等培养基在60度左右的时候加入的抗生素，另外，挑菌落做过PCR，结果用AOX做引物时只在约580bp有带，用克隆基因是所用的引物扩增时会出现与目的基因大小相同的带，不知为什么？
qhyu (2014-2-19 11:11:55)

60度应该没有问题啊，是否确认添加进去，我这里一个技术员做PCR扩了几次告诉我说扩不出来，我当时很纳闷，因为之前我是验证过的，能扩出来，我就拿了他的实验记录，一看，结果是因为buffer只加了一半！还有一次是把buffer接错了，还有一次是用微量移液器的时候，酶没有完全打进反应体系中，结果都没有出来！
所以这里有个疑问就是转化时空白对照做没有，转化条件能不能说详细点？
我做的转化效率最高的是500多个个/ugDNA，没有做到资料中的那么高的转化效率。你那长满版转化效率该有多高啊？
不过依我做过的近十次电转化结果看，如果筛选平板能长起来，基本上都是正确的重组子，只是我的转化每次板上长的都少，最多的200ul涂板长100多个，建议楼主仔细检查一下实验记录，步骤，看看是否能发现点问题！
提供一个简单的方法：挑单菌接入10mlBMGY过夜摇转0.5ml入新的50ml的BMGY，培养至OD600=4-6，离心收集菌体，用10ml BMMY重悬，培养每隔12h添加1ml10xM，48，72，96小时，取样1ml浓缩后电泳！
试试看有没有表达！
qqq111 (2014-2-19 11:12:32)

我把在板上长出的菌落，用冻-煮-冻法制备PCR模板，用AOX引物做PCR，结果全部都有580bp左右的带，很亮很特异，应该不是空载体吧，电转化前的质粒我都是经过双酶切验证是重组质粒的。
至于转化条件，感受态我用的是invitrogenZaA载体说明书上介绍的，只不过实验室没有分光光度计所以菌体的OD值只是估算一下，可能偏小，用预冷的水洗三次，再用山梨醇（日本产的）洗一次，最后用山梨醇回溶，加入乙醇沉淀的Pme I线性化质粒，冰浴5分钟，电转化用的是BIORAD电转化仪上厂家设定好的毕赤酵母的转化程序，由于电转化仪不在本实验室，所以打开后直接就转了，没预热。转化完成后，立即加入YPDS，30度放置约1.5小时涂板。另外，由于条件限制，我每次只摇40ml菌做感受态，全部菌体最后溶在约80微升山梨醇中。
另外，电转化的质粒我用的分子克隆上介绍的中量法，提100毫升，然后用PEG法纯化的。
这些是我的步骤，高手帮我看看有什么不对的地方吧，谢谢
qhyu (2014-2-19 11:14:04)

不要这么客气，条件所限，可以理解！
你的PCR验证有没有用目的基因的引物扩增验证过啊？580bp的片段是空载体也有的！
可以用个交叉引物来扩增试试，比如用AOX5和目的基因的下游引物或目的基因的上游引物和AOX3引物进行扩增，看看如何？
invitrogen上的电转化方法要求质粒浓度很高，并且根据我的经验转化效率也有限，我试了本版帖子里的一个改进的方法就是不单单是山梨醇来洗涤，好像还好些，并且质粒浓度要求也不高，当然我的转化效率远远不及文献中的数据，但对我们筛选已经足够了！
你试试我上面的方法，当然上个帖子里的方法是对MUTs的，如果是mut+，可以按一以下方法：单菌——BMGY10ml——过夜——转2.5ml入100mlBNGY——摇至OD600=6后离心用20mlBMMY重悬，每隔12h添加甲醇至终浓度0.5%，48h、72h、96h取样2ml。TCA沉淀后电泳！
分子量较小，跑电泳要注意时间！
qqq111 (2014-2-19 11:16:33)

我要表达的是一个病毒的囊膜蛋白，文献中相关研究都都是采用pPIC9K载体，若这个ZaA载体还是做不出来的话，是不是换9K载体会好一点？
qhyu (2014-2-19 14:25:51)

呵呵，本版的酵母表达专区有很好的经验可循！
我现在做的只是pPICZ系列和pGAP两个类型的，还在继续摸索中！