【求助】蛋白纯化后反相上目标峰貌似由两个峰组成

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-2-19 14:47 作者: zhy平平来源: 分析测试百科网

最近纯化一个亲水性比较高的蛋白，经过几步纯化后电泳上纯度在95%以上（但是目标蛋白的带型都是比较宽的如下图）。跑反相，目标蛋白峰（15.485）明显可看出似乎由两个连续的峰组成。出现这种情况我们自己分析了下可能是因为目标蛋白1.部分糖基化了，或2.存在异构体。要证明上述假设的话需要怎么去做呢，纯化上有没有比较好的方法（目前这种纯度我们过了阴离子、阳离子和疏水层析）去分离?有什么好的分析方法来证明是异构体或者部分糖基化？请高手帮忙

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ending (2014-2-19 14:47:56)

你的表达体系是CHO吗？试一下PNGase切完后跑胶
或2.存在异构体
也可能是降解
zhy平平 (2014-2-19 14:50:12)

表达系统是酵母的，如果用PNGase酶的选择上有没有讲究，比如说内切或N端的？要是降解的话PAGE电泳上应该能看到的吧？
喵咪 (2014-2-19 14:50:53)

酵母容易降解，PAGE电泳上未必能分开，试试梯度胶或run时间长一些。
如果rHPLC能有两个峰，试试疏水层析的梯度缓一些，或用小粒径树脂/不同的疏水树脂等，只能试。
fei1226com (2014-2-19 14:52:57)

try IEF
zhy平平 (2014-2-19 14:54:52)

IEF是个选择,但是我们估计如果是糖基化的糖基化也不高(如果高的话,分子量可能差异会大,分子筛上应该能反映出来),而酵母中糖基化甘露糖等比较常见,它们带电少,IEF不一定能检出来。明天试试反相，梯度拉缓点看看能不能分出来。如果是异构体的话有什么办法能确定呢？
c86v (2014-2-19 14:55:27)

如果是异构体的话有什么办法能确定呢？
何种异构体？具体讲，三级结构变化或一级序列改变？
PNGase可以去除N连接糖，你可以酶解后看看是否HPLC行为改变，或如同你所说梯度缓一些
zhy平平 (2014-2-19 14:57:20)

有报道用Mono Q分离不同修饰蛋白的例子，以及末端降解2个氨基酸的例子。不妨一试。
如果有活性测定办法，而且异构体在活性上有区别的话能否试试？
如果有analytical的Gel filtration，可以取峰的不同部位，看他们的profile是否不同。能否发现彼消我涨的规律。
供您参考。
zhy平平 (2014-2-19 15:24:42)

您说的mono Q分离的例子能告诉我具体的出处或文献吗？
另外，如果确实存在的是异构体的话活性肯定是要测得，如果两者差不多的话也用不着去分离了，现在关键是还找不到合适的分离方法将两者区分开，今天我们把样品过RPC （过RPC基本上也只有一个峰，只是将峰的不同部位分别收集）后HPLC跑反相，结果原来的主峰上出现了双峰但并没有分开。
关于analytical Gel filtration能不能解释的稍详细些，不是很明白，谢谢
yjf1026 (2014-2-19 15:25:06)

1）由P. pastoris表达的蛋白质发生糖基化尤其是N-糖基化的现象比较常见，并会在page电泳中产生两条带，
2）检查目的蛋白中是否含潜在的N-糖基化位点：Asn-X-Ser/Thr（X代表任何氨基酸）
3）如果存在潜在糖基化位点，分别用Endo-H和PNGase F处理后再分析（一般PNGase F 就能消化糖链），
我看到多篇文献用毕赤酵母表达外源蛋白因糖基化在电泳中出现两条宽带的情况，通过消化糖链都得到了一条较窄的带，你可以参考一下。
ukonptp (2014-2-19 15:25:51)

具体文献找不着了，不过文献上看过，在一个conference上也听人报告过。
我觉得比如glycolylation这种修饰，如果程度够大而且改变表面电荷的话，应该可以分离的。但如果位点很少，而且包埋起来了的话当然更困难。
有成功的例子不代表就一定适应您的蛋白。
analytical gel filtration，跟一般SEC是一样的，只是可以分析很少量的样品，如果有autosampler的话，把peak的不同fraction跑一遍，看profile是不是有变化，是不是规律，就知道是不是两种形式的蛋白了。不知道结合质谱能不能要到你想要的结果，没做过。请有经验的战友继续。
楼上站友的建议很不错，同样您可以分析一下潜在的其他修饰位点。
zhy平平 (2014-2-19 15:26:25)

根据站友提供的糖基化位点比对我的蛋白序列，没有找到相应的位点，应该还有其它形式的糖基化位点，我再试着找找。另外，我们觉得要真的是糖基化了的话也可能是修饰位点少（我们样品过了离交，疏水等几步层析，修饰位点多的话应该能分离的），判断是否糖基化除了用酶切外，我们还想用ConA亲和层析试试看，据说这个对糖基化比较灵敏。
SEC今天我们就准备试试看，结果出来再跟大家讨论。
另外，还有个问题，就是跑反相不同厂家的乙腈对保留时间等影响大吗？下图是两批不同乙腈跑上述样品的结果，峰型变化有点大的说（最后一个是加了4.5M的盐酸胍）

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summerxx (2014-2-19 15:27:09)

是异构体或者有轻微降解
sr9971 (2014-2-19 15:27:31)

用等电距焦能检测出来，分离上可采用精确的PH变来实现