【求助】大量表达蛋白怎么出不来啊

最新回复

• c86v (2014-2-20 16:14:40)

  
  可能是表达量很低，效果不好。

• luoliqiong (2014-2-20 16:17:51)

  
  那有什么方法可以提高表达量啊

• windy+++ (2014-2-20 16:18:11)

  
  1.大量表达后取菌液样品做电泳或WB,确定蛋白未表达还是表达了未纯化出来？
  2.制备的蛋白上清液最好制备后立即过柱纯化，放置时间过长蛋白可能聚合或发生其他变化，导致His-tag不能充分暴露，无法纯化
  3.有些蛋白由于本身构像的原因，His-tag不能充分暴露，无法纯化，建议换标签，或变性条件下纯化，但之后的复性会比较麻烦

• luoliqiong (2014-2-20 16:18:32)

  
  我还有个问题，老板只告诉我这几种蛋白分子量在80KD左右，做小量时在80KD附近有不少条带，我不能鉴定是不是就是我想要的。是不是还需要做western啊？
  还有就是你说大量表达后取菌液样品做电泳，菌液中杂蛋白都狂多，条带混成一片，根本看不清楚，之上10ul也是如此，请问应该怎么处理？
  非常感谢！

• zsxan1990 (2014-2-20 16:18:52)

  
  做电泳时，必须要用未诱导过的细菌样品做阴性对照，诱导后或有蛋白表达，与阴性对照比较在相应位置可以看见一条明显的比较粗的条带，要进一步确定是不是目的蛋白，做WB是必须的。菌液上样7ul就够了，上样量太大，条带分不清楚。还有要确定你的蛋白是可溶表达还是包涵体表达，以采取不同的纯化方法。纯化时蛋白上清，沉淀做WB看看目的蛋白到底在哪里。

• luoliqiong (2014-2-20 16:19:11)

  问高手，上柱后收集的蛋白在跑电泳前需不需要摇匀一下？万一蛋白分布不均匀，会不会影响电泳结果。 谢谢！

• luoliqiong (2014-2-20 16:19:30)

  文献上说要在对数生长的中后期诱导，具体是OD600值多少啊？
  多谢

• luoliqiong (2014-2-20 16:19:53)

  
  如果超声破碎的菌液大概在3-4ml,那么镍柱应该上多高？柱高和上样量是什么关系？

• wmp1234 (2014-2-20 16:40:58)

  
  感觉楼主试验程序不太对，我觉得应该是这样的：
  1：小量诱导表达，定位表达蛋白(包涵体，可溶）
  2：大量表达后取少量菌液SDS-PAGE确定目的蛋白表达。
  3：过柱收集上样峰，确定蛋白吸附了。
  4：收集梯度咪唑洗脱峰，判断咪唑洗脱浓度。
  数生长的中后期诱导，具体是OD600值多少啊？
  0.6-1，这个并不那么死，其实做多了都不测OD值了，菌液比较混了，就诱导。
  如果超声破碎的菌液大概在3-4ml,那么镍柱应该上多高？柱高和上样量是什么关系？
  准确点说这个和你上样体积没有必然关系，而是和你蛋白的表达总量有关系，NI对蛋白的吸附是有上限的，吸附达到饱和，在多的蛋白也挂不上去了。经验是500ml菌体，15cm的高度应该可以（有个问题是不知道你的柱的大小，我们的柱子大概是1.5cm的直径）