查看完整版本请点击这里：
【求助】做WB已经有半个月了，可是没有跑出条带
【求助】做WB已经有半个月了，可是没有跑出条带
我做WB已经有半个月了，可是没有跑出条带。转膜之前的步骤我已经没有问题，做了几次后都用丽春红进行了膜的漂染，有蛋白条带，这说明蛋白我已转到膜上，没有出现条带的问题可能出现在后面的步骤中。
转膜后先摇床上用TBST洗3遍，每次5分钟，我是放在培养皿里的，用5%的脱脂牛奶（TBST配制）室温摇床上封闭1h，封闭后再用TBST洗3遍，每次5分钟，我一抗是兔抗（S Curz），1：200稀释（TBST稀释），将膜按Marker标志把目的蛋白位置处的膜剪下，置于杂交带中，把一抗加进去（这样做是为了节省抗体），4度过夜。
第二天，TBST洗3遍，每次5分钟，加入二抗（我是国产的，羊抗兔，1：10000TBST稀释），摇床室温1.5h，然后TBST洗3遍，每次5分钟。
化学发光剂进行发光5min，在此过程中我已经注意了膜的正反面。然后就去暗室进行曝光，曝光了很多次，数秒至数分钟，可是都没有出来。
请麻烦看一下，我的问题出在哪？是不是抗体有问题？
还有，我看了一些资料说，可是用点杂交的方法对抗体进行验证，请问具体怎样进行，还有什么方法可以对这后面的各环节进行验证的没？
静候回复，谢谢！
查看完整版本请点击这里：
【求助】做WB已经有半个月了，可是没有跑出条带
【求助】做WB已经有半个月了，可是没有跑出条带
最新回复
+小生怕怕+ (2014-2-20 16:55:03)
i think these processes you should think.
1. the primary antibody is work or not. you can try a higer concertration(1:100).
2.the second antibody seems too low, and i always use 1:2000.
3. for you never get the protein, don't cut the membrane just for save the antibody.
4. you can delay the explore time to 1hour, even over night.
Have a good luck!
xingyi08 (2014-2-20 16:55:21)
剪取适当大小的膜，甲醇浸泡15s后晾干，然后再膜上点上不同浓度一抗，晾干后再加上你所用二抗说明书推荐稀释浓度的最大值，然后显色，看是否能显色？园子里有关于dot-blot的具体操作，你搜索下
另外，对你封闭这一步，我觉得有可能时间短了点，延长封闭时间至2h试试看
祝你成功！
vera+ (2014-2-20 16:55:53)
请大家就看一下，具体步骤或什么有问题嘛？还有，请问有dot-blot验证抗体的protocol吗？谢谢！
glass (2014-2-20 16:56:17)
delay the explore time to 1hour, even over night?不可思议啊。
请大家就看一下，具体步骤或什么有问题嘛？
首先没有什么不可思议的，只是自己做的少。
其次你的问题在园子了都可以搜索的到，自己花些时间找找。
vera+ (2014-2-20 16:57:03)
做的少的确是我们的不足，但是delay the explore time to 1hour, even over night，我在园子里从未看过，如果你看过，可以把链接找出来，让大家也都学习学习......
希望能真正理解救助者心里的人来帮忙解决问题，谢谢！
2541 (2014-2-20 16:57:24)
适当延长曝光时间看看很多时候加了ecl看不到条带，可以曝光20-30分钟试试
66+77 (2014-2-20 16:57:45)
vera+ (2014-2-20 16:58:15)
我今天又做了一次，换了新的2抗，可是还是没出来，晕死我啦！
哎！怎么办呢？
00无名指00 (2014-2-20 16:58:40)
ECL显色5分钟再去曝光？！
应该加ECL后就立刻曝光！最好在暗室里把曝光用的东西准备好后，开红灯，加ECL进行显色，再关灯直接肉眼观察有无亮带出现。
不用全部重新来过，只需要把原先显过色的膜TBST洗三遍就可以重新显色了。
新手做的时候ECL发光有时会淬灭，跟操作或者ECL的质量及存放时间有关。你的八成儿也是这个原因
00无名指00 (2014-2-20 16:59:04)
如果按上面我说的步骤没结果，就改动二抗。
从来没做出过结果，那就宁肯背景深点儿吧！——二抗改到1：2000，常温1.5h，洗膜，再显色曝光。
还没有结果的话再给你出别的招。
【求助】做WB已经有半个月了，可是没有跑出条带