【求助】包涵体溶解（去污剂与尿素）

最新回复

• 了了 (2014-2-20 17:00:33)

  
  1%或者0.5的浓度不会有影响吧。我感觉对溶解没有什么影响，倒是比较纯了

• okhaha (2014-2-20 17:01:23)

  
  请问大家是怎么溶解包涵体的，我做下来感觉包涵体不好溶解

• okhaha (2014-2-20 17:01:47)

  包涵体绝大部分都是可以用尿素直接溶解的，溶解不好与方法也有一定关系。我是先把沉淀捣散，再加尿素去溶。如果在一团刚离心好的沉淀中直接加尿素，我感觉会形成一个一个的小体，不太好溶解。如果实在不行，比如溶液看上去比较混浊，那可能是不能溶解。你可以再用盐酸胍试一下。

• okhaha (2014-2-20 17:02:04)

  现在好像溶解的还可以，但新的问题又出现，挂柱效果不好，请大家多多指点。溶解后的包涵体要过柱纯化的.以下是我的操作步骤：洗涤过后的包涵体（500ml的菌液）用150ml 8M尿素（缓冲液是pH7.5的100mMHEPEPS和10mM咪唑，即所用Ni柱的binding buffer）和1.5ml 1MDTT溶解16h，并在磁力搅拌器上搅拌。离心后的上清过Ni柱时，发现流出液呈淡黄色，将收集样品跑SDS-PAGE，发现用尿素处理的上清中目的蛋白的含量与过柱是的样品收集液、洗脱液中的目的蛋白的含量差不多，这是不是说明挂柱效果不好呢？请问是什么原因呢？多谢各位的指点

• 了了 (2014-2-20 17:02:53)

  你的DTT是不是与尿素一起混合了？那就是终浓度为0.01M，对吧，DTT最好是小于1mM，它把柱子都还原了，还怎么挂柱子啊。你可以试试不加DTT的溶解啊。再过柱子，跑胶看看。

• okhaha (2014-2-20 17:03:18)

  是的，DTT的终浓度为10mM。
  不加DTT可能包涵体不好溶解，那我再试试吧，谢谢啊，对了，还原的柱子还能用吗？

• huifeng0516 (2014-2-20 17:03:52)

  
  你好，我想问一下，包涵体一定要用去污剂洗么？我查资料，有的人好像也不洗的啊，只使用PBS洗啊。有什么区别么？我刚接触，不是很明白，还希望各位赐教！

• okhaha (2014-2-20 17:04:20)

  
  tritonX-100是一种去污剂，用tritonX－100洗是为了洗去一些膜蛋白与细胞膜碎片，应该是有利于包含体的溶解吧