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【求助】包含体
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我现在做的是用pET32a+载体的一个重组蛋白，原核表达出大量包含体。我进行了包含体的纯化，最后用8M的尿素溶解的，但是纯化后蛋白还是不纯有很多杂带，这是否说明我纯化没成功？是不是包含体纯化后就能得出单一的目的条带，还是必须用组氨酸标记的柱子进行纯化，才能得到一个纯的目的蛋白？请高手指教，万分谢谢！
[ 本帖最后由 gmjghh 于 2014-2-20 20:51 编辑 ]
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最新回复
wmp1234 (2014-2-20 17:47:18)
一般来说包涵体中目杯蛋白的含量只点有50-60%，还有很大其它蛋白质一起形成包涵体，所以你想得到一个纯的目标蛋白，必需脾组氨酸标记的柱子纯化。
987789 (2014-2-20 17:47:35)
你的蛋白分子量多大
987789 (2014-2-20 17:47:51)
SDS-PAGE图发一下，看看都有哪些杂带，才能分析原因
gogo (2014-2-20 17:48:22)
包涵体纯化不仅包括尿素变性后各种色谱柱的纯化，尿素溶解包涵体前的洗涤过程也同样重要，如去垢剂洗涤、醇洗、低浓度尿素洗涤等方法，这些洗涤过程可以洗掉非包涵体类的杂蛋白和细胞碎片中的脂类。
包含体层析纯化最常用Ni柱，但是并不代表Ni柱可以得到很好的纯化效果，同样可以利用离子柱等进行纯化，
taoshengyijiu (2014-2-20 17:48:42)
LZ用pET32a表达的形成包涵体实在不划算，包涵体的复性不好玩的，得率一般也不会高，除非你摸索条件优化的很好。个人感觉可以尝试改变条件拿到可溶表达的组分的，尝试一下低温诱导、减少IPTG的用量等。
包涵体本身的纯度的确不高，不纯化时能有50%就不错了，洗涤一下倒是可以提的很高，好好摸索一下洗涤的条件吧，我前面一个蛋白洗涤后蛋白的纯度到了90%，后面的纯化就轻松了许多。可以尝试尿素、表面活性剂等多种方法，洗涤时间和次数都可以摸索。
复性后的蛋白不建议直接上Ni柱，那个填料狂贵啊！推荐先上一步离子交换，同时起到浓缩和初步纯化的效果。
yes4 (2014-2-20 17:49:01)
如果实验室条资金允许的话，上ni柱纯化是非常快的，纯度也蛮高的，嘻嘻，就是偶注射了兔子还没有获得效价有点郁闷：（
BUK (2014-2-20 17:49:22)
不纯化，稍微处理一下，纯度一般可以达到90%
TAT (2014-2-20 17:49:56)
我用的也是pET-32a。。。纯化我觉得也是能做出来的（如图，左边的是纯化的结果，不过由于我没加PMSF,DTT一类的东西，蛋白断了。。。）。因为我做出来过一次。。。但是后来重复试验，总是有很多杂带。。。。天知道我怎么做出来的。。。郁闷啊。。。。所以我觉得应该还是自己操作的原因。 我觉得还是找个有纯化过的人教你做一次最好。我之前光从网上看资料，也没人说到破碎后的菌体碎片要去掉。所以指望我同学放假回来帮我做一次。
22333218.jpg
redbutterfly (2014-2-20 17:50:18)
如果你想纯化单一的条带，建议你切胶后电洗脱纯化。
柱子纯化也会伴随杂蛋白下来的。
gmjghh (2014-2-20 17:50:42)
谢谢大家的帮助，我最近也买了GE的his柱，纯化出的蛋白4度过夜后，发现蛋白出来了白色絮状的东西，这是蛋白质变性，还是柱子中出来的东西？我觉得是柱子的东西，在过柱子时能看到白色絮状物出现。SDS-PAGE看到纯化的目的蛋白的太少了，再除盐和复性后，那蛋白的量就更少了。老板让我提高蛋白的量，想通个纯化包含体来解决，但是8M尿素溶解的包含体不是很纯，有杂带。请高手指教，万分谢谢！
IAM007 (2014-2-20 17:51:01)
你的洗脱液的成分是什么呀？
4度过夜是否透析？
如果是透析的 话，可能是蛋白变性。
每个柱子的载量是一定的。
“老板让我提高蛋白的量，想通个纯化包含体来解决，但是8M尿素溶解的包含体不是很纯，有杂带。”
尿素好像并不能纯化包涵体哦
我用的是novage的柱子，感觉还是挺好用的，注射兔子也获得了效价
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