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【求助】纯化细节问题
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请问高手：
1上柱后收集的蛋白在跑电泳前需不需要摇匀一下？万一蛋白分布不均匀，会不会影响电泳结果。
2文献上说要在对数生长的中后期诱导，具体是OD600值多少啊？
3如果超声破碎的菌液大概在3-4ml,那么镍柱应该上多高？柱高和上样量是什么关系？
非常感谢高手指点！
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字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-2-20 22:33 作者: @花开花落@ 来源: 分析测试百科网
最新回复
pou (2014-2-20 22:33:26)
njkph (2014-2-20 22:36:32)
1、难道你加入蛋白样品和上样缓冲液后不混匀？上柱收集的蛋白应该主要分布在某个体积之中吧，不会有什么影响。
2、一般的菌对数期为0.6，不同的菌需要的OD不同，你应该根据自己的菌种，选择合适的OD。
3、你超声之后不是把样品全都过柱？样品超声后需要离心收集上清吧，全都过柱子不行吗？柱子蛋白载量不到最大，就能挂蛋白。我觉得柱高和上样量 没有关系。你可以先测你的蛋白浓度，根据这个选择上样的多少。
卓见
ero11 (2014-2-20 22:37:35)
@花开花落@ (2014-2-20 22:38:02)
@花开花落@ (2014-2-20 22:40:51)
我还有个问题，我的蛋白在80KD 左右，做小量鉴定时诱导和空白在80KD处没有明显区别，都有条带，难道这种蛋白基础表达就高？应该怎么解决呢？
多谢
birdfish (2014-2-20 22:42:13)
你可以换一个严谨型的表达宿主菌看看啊，象BL21(DE3)PLySs就可以的，这个带有T7聚合溶菌酶，可以严格控制表达，就是说在没有加诱导剂之前一般是不会有目的蛋白表达的。
guagua (2014-2-20 22:42:56)
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一般不需要混匀，因为溶液滴落时会有一定的混合作用，比如在做荧光蛋白时你可以看到收集管中颜色上下都是均匀的，除非你可以看到明显的沉淀。
@花开花落@ (2014-2-20 22:44:03)
呵呵，多谢指点，我还想问一下，如果诱导和空白的表达情况差不多，；有没有可能是因为质粒丢失啊？有没有必要去用原来的质粒重新转化一下啊？
还有就是有哪些可行的方法可以降低本底表达？
不胜感激
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