【求助】目的蛋白表达不出来

最新回复

• pengke1983 (2014-2-21 15:40:18)

  
  才诱导三小时！
  把诱导时间延长点试试！

• pengke1983 (2014-2-21 15:46:06)

  还有，不 晓得你的小肽有多小！
  10KD以下的话，最好跑tricine-sds-page电泳！

• hold住 (2014-2-21 15:46:25)

  
  tricine-sds-page电泳,不是很好跑啊.

• tuuu2 (2014-2-21 15:48:40)

  
  我的目的蛋白是4.2KD的
  我跑的就是Tricine电泳

• gogo (2014-2-21 15:53:22)

  
  10%浓度太低了吧，建议增加胶浓度，同时那么小的蛋白没有必要跑到胶低，即使溴芬兰没有跑出，蛋白也很容易跑出去，跑到中下部就可以了，可以确保你的蛋白没有跑出去

• mimili_901 (2014-2-21 15:53:42)

  
  10%浓度太低了吧，建议增加胶浓度，同时那么小的蛋白没有必要跑到胶低，即使溴芬兰没有跑出，蛋白也很容易跑出去，跑到中下部就可以了，可以确保你的蛋白没有跑出去

• gogo (2014-2-21 15:54:09)

  怎么不用梯度胶呢你的蛋白早就跑出去了肯定没有了

• tuuu2 (2014-2-21 15:58:11)

  
  请问，把表达的量放大是什么意思啊？我在分离胶中加了甘油，这几天跑了几次16.5%的胶，但是还是没有看出差异，在跑胶的过程中，指示剂在分离胶中跑的很快，我用的是80v跑的分离胶，指示剂跑出去时，蛋白只跑了分离胶的一半，是不是胶浓度越大，用的电压要减小？

• tuuu2 (2014-2-21 15:59:47)

  怎么不用梯度胶呢你的蛋白早就跑出去了肯定没有了
  
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  我跑的是梯度较，浓缩胶是4%的

• xue258 (2014-2-21 16:03:01)

  表达量放大，我的意思是如果你的表达量没有10mg/L发酵液，后面要想大量的获得蛋白是很困难的，尤其是如果你的蛋白要是转让到企业的话。
  我没听说过胶浓度提高就改变电压的说法。Tricine电泳的正负极缓冲液很重要，检查一下配错了没有，一开始尽量不要回收利用，当你把体系建起来后可以回收用，毕竟科研经费有限。
  我加甘油跑过，还是可以的，但没有尿素效果好。还可以尝试加上夹层胶跑跑看。电压不要太高，第一次跑时我120V跑到底，结果2h跑完了，就一条带，但明显是没有分开。
  如果做不出来不要盲目再去试，好好检查一下配的试剂有没有问题。

• xiaoxiaoniao (2014-2-21 16:04:27)

  
  我最近也在做小分子蛋白的串联表达，表达的蛋白大概6K多，但通过Tricne小分子蛋白电泳未见目的蛋白条带。37℃，诱导了5个小时。不知道是什么原因，急呀！

• one (2014-2-21 16:04:47)

  呵呵，你那个分离胶浓度太低了，目的条带比溴酚蓝迁移速度还快，再他们提议表达量放大的基础上，还可以考虑用低分子量预染的蛋白Marker看到跑试试呢，不放大估计还是看不到哦！

• 喵咪 (2014-2-21 16:05:36)

  
  同意前几位的说法，你用的ＳＤＳ胶浓度太低了
  建议用２０%以上的，可参见　蛋白质技术手册
  最好改用tricine胶
  另外，小蛋白易受蛋白酶降低，可尝试加一点蛋白酶抑制剂
  如果表达量低的话也会使ＰＡＧＥ不可见，细菌裂解液可以用饱合硫酸铵之类的浓缩一下上样，上样可用5倍的buffer,配制方法参见蛋白质技术手册，目的是使目的蛋白的上样量尽量的多。
  还是不可见就做一两个western，灵敏度更高些。
  再不行就换载体，换宿主菌重新来。
  还有个建议，这个小蛋白内果有很多大肠稀有密码子话就很难表达了，不妨到cuturl('http://www.evolvingcode.net/codon/cai/cais.php')　　　cuturl('http://gcua.schoedl.de/')　这两个地方分析一下，实在不行就重新合成基因，反正也不长。

• H2O (2014-2-21 16:06:02)

  
  可能原因：
  1. 楼上几位已经探讨过的跑胶问题，不再累述！
  2. 表达体系：
  也许你没有做过密码子优化，你的基因涉及多量稀有密码子，而表达菌又不提供稀有密码子翻译是所需的tRNA，导致翻译终止。建议更换宿主菌。
  个人认为表达的问题可能性大，关于表达，园子里很多主任给出过解释。
  后续可以再讨论，祝试验成功！

• 66小飞侠 (2014-2-21 16:06:22)

  
  不知道你用的是什么表达系统，原核系统对一些蛋白质是有限制的，如跨膜蛋白在原核系统中就无法表达，因此，建议你查清楚目标蛋白质的特性，选择合适的表达系统，再加上楼上的所有建议，OK，祝你好运！

• 49888 (2014-2-21 16:08:24)

  原核系统表达融合蛋白相对来说蛋白的丰度还是不低的,尤其是分子量较小的目的蛋白.我建议楼主可以选择一些比较理想的表达载体,譬如PGEX系列的质粒.还有就是一定要确保你构件的基因序列阅读框正确无误,最好在转录起始部位前面加KAZAK序列,可以增加转录效率.最后建议低温诱导表达,16度,诱导过夜看看.超声裂解时别忘低温,添加DTT以及蛋白酶抑制剂,另外胶不要配太稀,祝好运.

• xyw5 (2014-2-21 16:08:46)

  那么小的蛋白基本上是不要去做诱导表达，根据具体的用途采用融合表达，如果最终的实验不能有融合蛋白部分，可以通过酶切去除融合部分，得到完整的小肽，如果继续去做小肽直接表达，就只能祝你好运啦！

• fsdd817 (2014-2-21 16:09:22)

  
  那小蛋白诱导表达的成功机会很低，是吗？