【求助】关于western blot 的原理有些不解

最新回复

• yueban-1147 (2014-2-22 15:30:01)

  
  封闭只是封闭膜上没有结合蛋白的位点
  对转移上去的蛋白没有影响

• okhaha (2014-2-22 15:30:35)

  
  求助：我遇见了一个问题，即我的蛋白质（分泌型）浓度不高，跑SDS-PAGE时观察不到，我想将我的菌液上清浓缩后再跑电泳，不知浓缩前有没有必要作透析，以去除盐离子？谢谢！

• ffaa (2014-2-22 15:31:26)

  
  对于二楼的解释,有些疑问,封闭液是非特异性封闭的,它是如何区分目的的与背景的结合位点呢?
  我认为封闭是全面的,但这种结合有时动态的不牢靠的,也就是说,封闭液对膜非特异性结合,结合是动态的.这时,我们加入抗体以后,由于抗体与目的蛋白的结合能力要强于或远强于封闭液,在这样的强势之下,封闭液的蛋白会被抗体所取代;而对于抗体的非结合位点,它的结合能力或许还不如封闭液的强(或者比较接近),这样在封闭液成分占大多数的情况下,抗体的背景非特异性结合就相当弱了.
  不知解释的是否清楚,请大家指正!

• mybioon (2014-2-22 15:32:12)

  几年前我被学生的这个问题问住了，印象颇深。
  我的理解是支持panloose的观点。
  
  [ 本帖最后由 mybioon 于 2014-2-22 15:33 编辑 ]

  
  22768919.snap.jpg

• u234 (2014-2-22 15:34:16)

  我的理解是支持panloose的观点。
  
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  agree
  我的理解：PVDF膜就好比一个可容纳各种蛋白的筛孔样结构，转膜后，部分筛孔被从胶里转过来的蛋白占据（包括目的蛋白和其他杂蛋白），而没有被占据的孔道（或没有饱和的）就需要用封闭剂来填充，以防止被一抗占据了而洗脱不掉。
  

• tangxin_80 (2014-2-22 15:34:35)

  
  想象成占座，一共500个座位，特异性的5个，先占进去，然后让BSA占剩下的495个座，但是特异的座位已有人坐了，就坐不了了，抗体再近来识别那5个特异性的家伙就是了

• 831226 (2014-2-22 15:35:03)

  
  现在的问题就是封闭液是否与蛋白相互结合,如果是不结合的话,用于免疫荧光的封闭液封闭的是什么事物,难道不是非特异性的蛋白抗原位点吗?(注:免疫荧光与western所用的封闭液成分其实是接近的),那么western中的封闭液也应该可以和蛋白结合,那么解释应该是结合效率不同的问题.不过,还是同意SmallDonkey的比喻!帮忙解释下,呵呵!

• cbou876 (2014-2-22 15:35:23)

  目的蛋白、杂蛋白和封闭液似乎都只能和膜非特异结合。
  似乎所有的蛋白都能和膜非特异的结合，只有特异的抗体才能和对应的抗原结合。
  这两点结合起来考虑是不是就可以解释了！

• guagua (2014-2-22 15:36:19)

  
  如果是这样的话就应该是了,可以解释了,谢谢楼上的,楼上楼上的,楼上楼上楼上.....。这次讨论矫正了我的一个错误认识，谢谢大家！

• changlhsyo (2014-2-22 15:36:44)

  
  请恕在下愚钝，那么让封闭液和膜非特异结合的目的是什么？如象楼上说的那样可否理解为加封闭液的目的仅是为了防止背景染色？

• 66小飞侠 (2014-2-22 15:39:54)

  我的理解：PVDF膜就好比一个可容纳各种蛋白的筛孔样结构，转膜后，部分筛孔被从胶里转过来的蛋白占据（包括目的蛋白和其他杂蛋白），而没有被占据的孔道（或没有饱和的）就需要用封闭剂来填充，以防止被一抗占据了而洗脱不掉。
  
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  楼上战友说的没错，封闭液与膜上的孔非特异结合就是为了把空余的孔给占据，避免后面加入的一抗进入这些空余的孔（接着还有连锁的二抗三抗底物结合上去），这样也就降低了背景色。

• 了了 (2014-2-22 15:40:28)

  
  请恕在下愚钝，那么让封闭液和膜非特异结合的目的是什么？如象wgqsdams说的那样可否理解为加封闭液的目的仅是为了防止背景染色？
  可以这么理解吧，试想如果不是封闭液与膜非特性结合，那么这一些区域将会被后来的一抗所结合，如果是这样的话，加上二抗孵育显色以后，除了特异性蛋白之外，其背景就可想而知了

• remenb (2014-2-22 15:41:08)

  
  我是这样理解
  问题是一抗为什么在膜被封闭液封闭后还能和特异性蛋白结合？
  首先：为什么蛋白会和转到膜上去（膜结合蛋白的原理）。
  聚合物具有的孔隙结构和内表面积吸附蛋白，从而蛋白就被吸附在膜上。
  然后：我们知道一抗也是蛋白，一抗也会吸附在膜上，要是一抗吸附在膜上，我们再加二抗、ECL。那么整块膜都发光就没有我们要看的条带了！所以我们要封闭没有结合蛋白的膜！
  再楼主的问题，因为膜上已经有蛋白吸附在那里，所以，当你家封闭液的时候是没法去替换蛋白。也就是想楼上有人说的被占位了！
  接下来就继续我们的实验，我们的科研！

• nut6694 (2014-2-22 15:41:45)

  
  请问，如果封闭是用5X的脱脂牛奶，那么一抗二抗稀释液是使用1X还是5X的封闭液稀释呢？这样有区别吗？

• xingyi08 (2014-2-22 15:42:28)

  
  最近要做发酵，觉得这篇文章不错：Expression, purification and characterization of rat procarboxypeptidase B in Pichia pastoris 是2007年的 文章来源：sheng wu gong cheng xue bao 即生物工程学报的英文版 作者是： Wang, D. J.
  Miao, L.
  Chen, H.
  Li, Y. Y.
  Chen, H. P.
  Fang, H. Q.
  谢谢大家！

• 小野花 (2014-2-22 15:42:55)

  用小牛血清、BSA、脱脂牛奶作为抗体的稀释剂，主要是因为这些蛋白在稀释液中加大了抗体的相对浓度，促进了抗原抗体的反应，
  我们实验室在做ELISA时一般用10％小牛血清作为封闭液，5％小牛血清作为抗体或样品抗原的稀释液。用1％BSA作为封闭液时，抗体稀释液用0.5％就够了，当然我也试过用1％的小牛血清白蛋白作为稀释液，最后显色确实比0.5％深，但不是深很多，这样1.不是稀释液中的白蛋白浓度越高就越好，够了就可以了，太多了，加大成本。2.理论上若稀释液中的白蛋白浓度非常高。也可能蛋白质本身的空间位阻，或蛋白质本身的电荷干扰，减低抗原抗体的反应程度。

• 小野花 (2014-2-22 15:43:21)

  对于你的一抗二抗我认为用2.5％的脱脂牛奶作为稀释液应该没有问题。

• bs4665 (2014-2-22 15:44:18)

  agree
  我的理解：PVDF膜就好比一个可容纳各种蛋白的筛孔样结构，转膜后，部分筛孔被从胶里转过来的蛋白占据（包括目的蛋白和其他杂蛋白），而没有被占据的孔道（或没有饱和的）就需要用封闭剂来填充，以防止被一抗占据了而洗脱不掉。
  
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  比喻不错,很形象. 一抗占据的并不是孔道,我想还是膜上的负电荷，如果没有预先的封闭，当滴加一抗的时候就可能产生吸附作用，继而出现非特异性染色。目的还是控制背景.(感觉跟免疫组化一个道理).
  

• feima+ (2014-2-22 15:44:49)

  
  那么封闭之后我们需不需要洗膜呢？

• okhaha (2014-2-22 15:45:44)

  
  由于现在一直做蛋白纯化，经常发现有些蛋杂白通过离子交换不能完全从柱上洗脱，影响纯化的效果，但从理论上说如果是一种蛋白，洗脱的条件应该是一致的，在某一离子强度应该可以得到完全洗脱，但情况往往没有想象的这么理想。所以感到相当困惑，哪位高手可以指点迷津，不胜感谢！