【求助】为什么曝光没有任何条带

最新回复

• 分子式 (2014-2-22 22:27:46)

  
  一抗、二抗多长时间？你的二抗是什么？显影液、定影液是否失效？曝光时间多少？
  请具体说下细节，以便分析

• 奇蒙kate (2014-2-22 22:28:46)

  
  内参是42kd ，一抗（兔来源)是4℃过夜后用TBST洗膜3×10分钟 ，二抗是羊抗兔 RT 1小时，TBST洗膜3×10分钟， 显影定影液是买过来的粉剂 自己按照说明溶解就可以的,显影3分到5分钟，定影一般是5分钟，压片一般是10分到半小时，也曾试过压一个小时，不过依然没有，大概是这样做的，我自己考虑会不会是洗膜时间过长 一抗、二抗洗脱掉了，另外二抗浓度用不用继续调高呢？
  补充一下：胶片是08年1月份就过期的 用没有影响

• 分子式 (2014-2-22 22:29:04)

  
  1胶片是08年1月份就过期的
  别人用过怎么样,如果效果不好,还是买新的吧,也不贵
  2.如果显影液淡黄色,还可以用,如果深褐色,最好重新配
  3.如果有荧光,压片2-5分钟即可,如果没有,至少10分钟以上,但是1小时也没必要
  4.你的样品直接跑胶,考染有无条带,是不是层次比较清楚,发张图看下
  GOOD LUCK

• ii077345 (2014-2-22 22:29:28)

  
  可能是发光液出现问题 你可以问问用此发光液曝光的其他人试试

• 奇蒙kate (2014-2-22 22:29:46)

  
  谢谢 前辈的热心关注了 我将转膜后的膜用丽春红染 是可以看到条带的 ，转膜之后的胶用考马染也可以看到条带（不是特指我要的条带)，是不说明蛋白未完全转完呢？
  我用发光液和点膜的二抗 试过 在暗室里观察是可见荧光的 ，可否说明二抗和发光应该没问题呢？

• owanaka (2014-2-22 22:31:11)

  我这2周做的也 是一样，什么都 没有，白板一块，郁闷呀，不知道是原因，不能曝光出条带，昨天请一个做的非常好的师兄重复做，也是没有任何条带，其中用了一个他原来做的蛋白为另一对照，全部均没有结果，白板一个，我做的目的蛋白是MMP-9,和MMP-2，分子量在92和75KD间，各种试剂均是新买的，为什么就是没有结果呢？现在就是B-ACTIN也没有？请大家帮忙分析？

• 奇蒙kate (2014-2-22 22:31:33)

  我想问一下肺组织用什么内参比较可靠呢？我做的蛋白分子量有94KD 78KD 60KD ，另外想问一下actin和β－actin有什么区别？β－actin会不会因为生产的公司不同而应用的组织不同，有无具体分类？Smile问题多了点，再次感谢！

• 分子式 (2014-2-22 22:32:05)

  谢谢 前辈的热心关注了 我将转膜后的膜用丽春红染 是可以看到条带的 ，转膜之后的胶用考马染也可以看到条带（不是特指我要的条带)，是不说明蛋白未完全转完呢？
  我用发光液和点膜的二抗 试过 在暗室里观察是可见荧光的 ，可否说明二抗和发光应该没问题呢？
  
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  考马染也可以看到部分条带,是正常的,不可能完全转完.
  发光液和点膜的二抗 试过 在暗室里观察是可见荧光的 ，可基本说明二抗和发光应该没问题
  你的胶片是否有问题,显影液\定影液是否已经陈旧?请把你的显影过程叙述下

• 分子式 (2014-2-22 22:32:25)

  我这2周做的也 是一样，什么都 没有，白板一块，郁闷呀，不知道是原因，不能曝光出条带，昨天请一个做的非常好的师兄重复做，也是没有任何条带，其中用了一个他原来做的蛋白为另一对照，全部均没有结果，白板一个，我做的目的蛋白是MMP-9,和MMP-2，分子量在92和75KD间，各种试剂均是新买的，为什么就是没有结果呢？现在就是B-ACTIN也没有？请大家帮忙分析？
  
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  你的胶片是否有问题,显影液\定影液是否已经陈旧?请把你的显影过程叙述下

• 奇蒙kate (2014-2-22 22:32:42)

  
  我昨天同时做了两个抗体GRP94 及 actin ，今天换了新的胶片， 显影液和定影液都是7月10号溶解的 ，显影液看起来有些棕黄色 ，顺便请教一下 一抗、二抗孵育时膜的正面是如何放的？ 奶粉成块状的话是不就不能用了?会有什么情况

• 分子式 (2014-2-22 22:33:05)

  
  膜封在一个塑料袋里,如果一张,不存在正反问题;如果两张,可以背靠背。
  你的显影定影液最好临时配制。
  奶粉成块状，没过期应该还可以用。
  GOOD LUCK

• 奇蒙kate (2014-2-22 22:33:23)

  
  我想再问一下有做过肺组织和心肌组织的前辈 ,你们都用什么公司的哪种抗体做内参,我一直做不出来是不是内参选错了?

• nikun230 (2014-2-22 22:35:20)

  
  我的是160kd的，立春红染可见条带，饿曝光什么都没有，什么问题啊？发光液，胶片肯定没问题，三个星期了，一条带也没有。跳楼的心都有了。谢谢回复！

• uaubc (2014-2-22 22:35:43)

  
  我前一段时间也在做W-B实验，结果全是空白即使以前一段时间作的很好的条带现在一样的条件都没有结果就连ACTION都没有结果了~~~~~~~实在应该停下想象了 ：
  在我看到前面的战友发的帖子后~~~~~
  我在想是不是W-B试验与温度有很大关系！！！！！！！
  1 温度高目的蛋白的降解快 就是你的条带转的很好曝光一片空白（最近我有过经历）
  2 温度高在曝光时光淬灭的很快 几秒钟就没有了 ~~~~~
  所以我在想W-B 试验是不是与温度有关系 很大？ 最近试验停了 等天气转凉时再继续
  或者在曝光室安装上空调 （正在申报）改善以下条件~~~~~~
  如果你有这样的经历请跟帖~~~~~谢谢~