【求助】2D图片出现的全是竖条纹

最新回复

• zsxan1990 (2014-2-27 10:19:33)

  
  主要两个可能原因:1. 聚焦过度; 2. 第一向胶平衡不够充分.

• tangxin_80 (2014-2-27 10:23:48)

  
  .
  聚焦过度; 2. 第一向胶平衡不够充分.
  非常感谢。
  我7CM聚焦9800VHT,电压总上不去，1600V最高，每次平衡15分钟，我每次的图都一样，五次了，都不敢见老板了

• zsxan1990 (2014-2-27 10:24:08)

  
  您可以试一试平衡20~25min,但不要超过25min,否则可能引发蛋白的损失.
  关于聚焦电压上不去, 不知道您的样品是怎么处理的, 不推荐直接裂解液上样,经常会出现离子过高(并不是裂解液盐分高,而是样品带进去的离子),电压上不去.
  我推荐您将裂解后加1倍体积TCA-丙酮(1:9)低温沉淀30min, 12000g低温30min,再用水化液溶解, 上样即可.

• tangxin_80 (2014-2-27 10:24:26)

  
  样品处理过程：
  肝组织提总蛋白后溶在裂解液，高速离心去核酸， PULL DOWN，溶在裂解液，水化上样，谢谢你的帮助

• glass (2014-2-27 10:24:42)

  
  竖条纹是由于SDS-PAGE没跑好引起的.

• tangxin_80 (2014-2-27 10:25:00)

  
  竖条纹是由于SDS-PAGE没跑好引起的.
  谢谢。我也觉得有可能，因为我的MRKER跑得不好，但我单独跑二向，又很好。

• glass (2014-2-27 10:25:32)

  还有一个原因就是你IPG胶条放在二向胶上的时候有很多小气泡.
  不要用0.75%的低熔点琼脂糖,这个凝固太快,容易产生竖条纹

• yes4 (2014-2-27 10:26:04)

  个人认为纵条纹和聚焦关系不大，可能是你的样品有杂质，比如说核酸的污染。还有一个可能就是在第一向向第二西转移的时候出现了气泡。

• yes4 (2014-2-27 10:26:31)

  可能的原因及解决方法:
  1. 蛋白质从一向转移到二向时发生沉淀, 提高平衡的SDS浓度, 适当延长平衡 的时间;
  2. 蛋白上样量过大;
  3. 注意水质, 使用Millipore水;
  4. 胶条平衡后仍带有额外的DTT, 使用IAA平衡胶条,去除额外的DTT.
  LZ最好能给个大概的实验步骤,比如一向的聚焦vhrs数,平衡的步骤, 以便大家提出有针对性的建议.
  祝实验顺利!

• tangxin_80 (2014-2-27 10:31:14)

  
  不要用0.75%的低熔点琼脂糖,这个凝固太快,容易产生竖条纹
  那用什么琼脂糖？

• tangxin_80 (2014-2-27 10:31:31)

  
  蛋白质从一向转移到二向时发生沉淀, 提高平衡的SDS浓度, 适当延长平衡 的时间
  我平衡DTT和IAA各15分钟，4％SDS,
  30V10H
  100V1H
  500V 1H
  1000V 1H
  5000V 2H
  5000V 1H
  500V 10H
  电压上不去，9800VHT

• tangxin_80 (2014-2-27 10:32:53)

  
  将SDSA加到9％，终于有点了，难道我的SDS有问题？

• jujuba (2014-2-27 10:33:18)

  主要两个可能原因:1. 聚焦过度; 2. 第一向胶平衡不够充分.
  
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  我目前也是在做2DE，
  想请问一下，为什么这两个原因会造成竖条纹呢？

• tangxin_80 (2014-2-27 10:33:36)

  
  我解决了竖条纹，SDS平衡加大SDS浓度，谢谢大家

• ending (2014-2-27 10:37:59)

  不要贸然加大平衡液中SDS的含量,否则会特异性丢失某些蛋白,但同时也会特异性富集某些蛋白.

• ritou1985 (2014-2-27 16:25:43)

  为什么？
  高熔点才会凝固太快吧
  我们一般用的是1％的GE的低熔点琼脂糖
  
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  还有一个原因就是你IPG胶条放在二向胶上的时候有很多小气泡.
  不要用0.75%的低熔点琼脂糖,这个凝固太快,容易产生竖条纹

• ritou1985 (2014-2-27 16:33:32)

  
  GE手册上推荐2％，我们也是用的这个
  特异性丢失？这个怎么讲？
  
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  不要贸然加大平衡液中SDS的含量,否则会特异性丢失某些蛋白,但同时也会特异性富集某些蛋白.