【求助】为什么曝光是白板一块？

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-2-28 17:39 作者: xevin 来源: 分析测试百科网

我这2周做WESTERN BLOT,结果是什么都没有，白板一块，郁闷呀，不知道是原因，不能曝光出条带，昨天请一个做的非常好的师兄重复做，也是没有任何条带，其中用了一个他原来做的蛋白为另一对照，全部均没有结果，白板一个，我做的目的蛋白是MMP-9,和MMP-2，分子量在92和75KD间，测定蛋白的浓度也很高，丽春红染色蛋白条带也有，各种试剂均是新买的，为什么就是没有结果呢？现在就是B-ACTIN也没有？请大家帮忙分析？

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【求助】为什么曝光是白板一块？

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最新回复

xevin (2014-2-28 17:42:38)

另外还在一个问题，测定MMP-9、MMP-2（基质金属蛋白酶）是否不能用WESTERN BLOT法，应该用酶谱法？
hyuu (2014-2-28 17:43:35)

现在就是B-ACTIN也没有？请大家帮忙分析？

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如果可以排除样品本身的问题，是否考虑二抗不好，或者显色剂的问题？
因为什么都没有意味着根本没有能够显色的东西。跟显色关系最大的就是上面2个。
hyuu (2014-2-28 17:43:55)

QUOTE:
原帖由 xevin 于 2014-2-28 17:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
另外还在一个问题，测定MMP-9、MMP-2（基质金属蛋白酶）是否不能用WESTERN BLOT法，应该用酶谱法？
mmp这个东西，比起蛋白本身的表达，他们的活性应该更有评估价值吧？是否考虑做Gelatin zymography 看看活性？请参考
is2011 (2014-2-28 17:44:33)

可能是显影液的问题
以前我们做的时候也出现过，后来发现是显影液的问题
remenb (2014-2-28 17:45:14)

换个显影液，试试
remenb (2014-2-28 17:45:42)

你也可以先拿别人的显影液，试试看
30moonriver (2014-2-28 17:46:01)

我们是新的显影液也显不出来，白板一块，怎么办
tuuu2 (2014-2-28 17:46:20)

【1】增加蛋白浓度或者上样量。你说蛋白浓度挺大的，不知道有多大？蛋白浓度太大也不好，电泳的时候蛋白可能会跑的不均匀。另外注意蛋白是否是新提取的，注意蛋白时间长了降解的可能。
【2】增加一抗的孵育时间，增加一抗的浓度。可以先摇床室温1小时，然后再4度摇床过夜。一抗用5％脱脂奶粉稀释，这样一般会好一些的。
【3】增加2抗浓度和二抗的孵育时间。一般来说只要二抗是好的，浓度也够，显影、定影液是好的，那么背景荧光肯定会有的。
【4】增加在ECL中的时间。
【5】增加曝光时间。
【6】增加在显影液中的时间。
【7】注意所用器具要干净。
【8】如果这样还不行，那就要注意试剂的问题了。新的不一定就全是好用的。