【求助】western跑电泳时碰到的一个问题

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• 了了 (2014-2-28 17:49:40)

  
  胶的比例不对.或者你上层和下层的buffer PH值返了

• INK (2014-2-28 17:50:07)

  
  我配胶的比例如下：
  10%分离胶：
  超纯水：8.0ml
  30% acrylamide mix：6.6ml
  1.5M Tris（ph8.8）：5ml
  10% SDS：0.2ml
  10% AP：0.2ml
  TEMED：8ul
  5%浓缩胶：
  超纯水：6.8ml
  30% acrylamide mix：1.66ml
  1M Tris（ph6.8）：1.26ml
  10% SDS：0.1ml
  10% AP：0.1ml
  TEMED：10ul
  一直这么弄的，应该没问题。

• ritou1985 (2014-2-28 17:50:28)

  可能和凝聚的时间太短有关。
  建议分离胶过夜，浓缩胶凝聚90分钟后上样。

• INK (2014-2-28 17:50:47)

  我分离胶和浓缩胶都是头天晚上做好以后，用袋子装好，里面放一点水，放在冰箱里面过夜之后第二天用的，也有做好以后就用的，都是这样的情况。

• glass (2014-2-28 17:51:06)

  
  不知道你的电泳缓冲液如何。不过我知道如果电泳缓冲液用了很多次的话，也会影响到电泳的效果的。一般来说，新配的电泳缓冲液电泳的效果要好一些。建议你也试试。
  另外补充下，这么热的天，可以将缓冲液预冷下。4度。就行了。

• INK (2014-2-28 17:57:02)

  
  电泳缓冲液我一般只用2次就换新的，出了这样的问题后我全部用新配的还是不行。至于温度，实验室是恒温，不会受热天的影响。
  电泳缓冲液配方：5×Running buffer （pH8.3）
  Tris-base（终浓度25mM）：9
  Glycine（甘氨酸）：43.2
  SDS（终浓度0.1%）：3
  加去离子水至600ml，保存在4℃。

• 水母 (2014-3-01 09:41:34)

  
  两个现象:
  1,你自己做的胶,MARKER跑得好,样品跑不好
  2,别人做的胶跑得好
  疑问:1,你自己用你自己做的胶跑过几回,如果是多次,你的胶是一次配的,还是每次跑之前新配的
  2,你用别人做的胶跑的时候的蛋白样品和你用自己做的胶跑的蛋白样品,是同一个样品吗,还是重新制作的样品
  3,用你自己的胶跑的时候,和用别人的胶跑的时候上样量一样不一样.
  我的感觉:
  在其它条件一切正常的情况下,蛋白条带过宽有这么些情况:
  1,样品蛋白浓度太高
  2,样品中盐浓度过高,或过低
  3,样品中含有某些杂质,可能导致样品粘度过高,或者杂质与蛋白发生一些不为所知的动作

• 68943512yao (2014-3-01 09:45:17)

  缓冲液的配方大家都是一样的，呵呵。
  不过看你说的确实跟我的不太一样。我的样品大概只需要30分钟左右就能压缩成一条线。
  如果说你配的东西都没有问题的话，那是否是你配胶的那些试剂的药品的问题呢？之前我用了以前实验室留下的Acr和Bis，胶就是不凝。但是别人用了做AFLP的大胶板的凝胶却没有问题。
  建议你也看看，检查下试剂也不会用很久时间的。

• INK (2014-3-01 09:47:31)

  我配的胶凝固时间都没有问题，外观也没有多大的差异。我的蛋白浓度一般是3-5ug/ul，上样量固定是20ug（以前也有用到50ug的，也能跑的较细），用我的胶跑，我自己的蛋白、Mareker和封边的1*的上样缓冲液都不能积得很细，粗粗的，而用别人做的胶，还是用我自己的蛋白、Marker和上样缓冲液却能积得很细。
  我现在只好一个一个的排除了（Tris-hcl，SDS，AP，聚丙烯酰胺，Temed），反复换不同的东西配胶，跑电泳看看。

• 68943512yao (2014-3-01 09:47:56)

  
  我当时也是打算反复换的。确实很麻烦的事情。尤其是我的问题是不凝，还很容易看出来。你的要跑了电泳才能知道，真的很无聊的一个过程。祝你好运。

• PINK (2014-3-01 09:55:07)

  碰到过两次类似情况：
  1.用了配错的Running Buffer
  2.Loading Buffer用了太久，冻融多次，失效了。
  第二种可能比较大，建议注意下。

• ending (2014-3-01 09:56:18)

  
  我觉得肯定是loading buffer出现了问题！一定是稀释浓度大了！你检查看看！其他应该没有问题！建议你可以用别人做得好的上样液看看

• remenb (2014-3-01 09:56:46)

  
  你的积层胶浓度多少？分离胶浓度多少？
  为什么用1*上样缓冲液？

• INK (2014-3-01 09:57:53)

  
  积层胶5%，分离胶10%，也做过12%。1*上样缓冲液是加在没有上蛋白样的泳道里面的。
  我的loading buffer在别人的胶里面也跑得很好。我想不应该是这个的问题。继续苦恼！

• zhenxin (2014-3-01 09:59:16)

  
  别人也同一台电泳仪器？

• summerxx (2014-3-01 10:00:16)

  
  是配胶的配方的问题吧和我碰到以前刚做时一样把聚合胶的1Mtris配成了1。5m的了结果和你说的一样

• duoduo (2014-3-01 10:02:31)

  碰到过两次类似情况：
  1.用了配错的Running Buffer
  2.Loading Buffer用了太久，冻融多次，失效了。
  第二种可能比较大，建议注意下。
  ......
  
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  此种状况遇见过，最可能是louding有问题。重配试试