【求助】WB结果背景重，非特异性条带多！

最新回复

• 7437654 (2014-3-01 17:23:28)

  可以换用NC膜，减少蛋白吸附，降低背景；
  封闭时间可以延长，过夜；一抗时间缩短，室温2个小时即可；
  降低上样量和加大一抗稀释度；
  延长冲洗时间和次数。

• tuuu2 (2014-3-01 17:23:45)

  如果你的BSA不是质量很好的话，比如进口分装的（Sigma)的，质量还行，其他的我们都试过，效果都不如牛奶，所以背景很重的话，如果没有好的BSA就换为牛奶封闭试一下，我想效果好一点。

• birdfish (2014-3-01 17:24:04)

  
  封闭过夜,1抗2h,2抗1h,显色
  封闭用脱脂乳

• gogo (2014-3-01 17:25:41)

  
  杂带多的话建议降低一抗浓度，背景很高可以降低二抗的浓度，另外，若ECL显影时荧光很强的话，曝光时间要缩短，几秒钟即可，然后把片子放进显影液中，密切观察条带，感觉合适的时候就立即拿出来。
  个人意见，仅供参考

• eric930 (2014-3-01 17:26:14)

  同意
  封闭用脱脂牛奶
  洗膜的时候时间长点

• jingling845 (2014-3-01 17:26:32)

  
  此外, 个人经验认为, 上样sample的处理方法也会影响抗体的特异性结合. 比如: 蛋白浓缩步骤等. acetone沉淀浓缩的蛋白样品就可以使抗体与非抗原产生非特异性条带.

• DNA (2014-3-01 17:27:24)

  
  我也是遇到同样的问题，非特异性条带多，背景高，最主要的是目的条带很淡。每次曝光的时间都很长，15到30分钟。这该怎么办啊？希望各位大侠指点，谢谢。
  可能是我要的目的蛋白本身的表达量太少了，这种情况应该怎么处理？谢谢！

• 49888 (2014-3-01 17:27:41)

  
  最近发现很多大侠都做WB都存在高背景，我自从六月开始做就没有做出好的条带，总是高背景，条带不清晰，是否和天气有关呢？是不是天气太热的缘故呢？

• 喵咪 (2014-3-01 17:42:22)

  
  except bolck more time, another way is purify your polyclonal antibody due to poor specifity of your antibody. use protein A or G, or make antigen-sepharose first, then purify. later method usually better.

• dotaaa (2014-3-01 17:42:42)

  
  经过很多的问题，现在我做的条带基本比较理想了，
  背景很清晰，基本没有杂带，条带很明显，每次ECL很亮，5秒曝光就可。
  总结经验：
  1 蛋白样本的处理：我用的是组织样本，用RIPA稀释蛋白，保持每个Sample浓度在3.5-4.5μg/μl，变性PCR仪 96℃、7min，这样变性后不会产生蛋白沉淀；
  2 每孔上样：从一开始的30μg到现在的20μg，明显20μg做出来的条带要清晰理想很多；
  3 SDS-PAGE：无殊；
  4 转膜：无殊，转膜后可以根据Marker的位置剪下你要的目的条带的膜，这样可以节省后续步骤的试剂；
  5 BSA：1h；
  6 一抗：1:1000，注意反复使用4-5次或1-2周加入新鲜的一抗1-2μl，加入后不要再用TBST稀释，否则新鲜的一抗就没有很大的效果了；
  7 TBST洗：10min，3次；
  8 二抗：1:20000，注意反复使用3-4次或1-2周加入新鲜的一抗1-2μl，加入后不要再用TBST稀释，否则新鲜的一抗就没有很大的效果了；
  9 TBST洗：10min，3次；
  10 ECL