【求助】western blot的困惑

最新回复

• 2541 (2014-3-03 09:54:52)

  
  1，2没问题
  3可以适当延长转膜时间并提高电流到120－150ma
  4封闭时间应该延长，室温两小时或者4度过夜
  5一抗用1：200试试
  6，7没问题

• 66+77 (2014-3-03 09:58:11)

  
  我觉得二抗可能稀释过了
  1 ：2000看看

• mysmdbl (2014-3-03 09:59:30)

  谢！不知其他战友还有什么建议，都帮小弟分析分析。还有就是我的转膜仪电流最高只能100mA。不知有没有在这种条件下做过的，请给点意见吧。

• douding66 (2014-3-03 10:15:31)

  
  1.湿转没做过，不过既然考染无蛋白，应该效果不错啊。
  2.背景高，可能的问题是抗体太多或膜没洗干净，看你一抗也不是很高，可以试试一抗37度两小时的条件，洗膜用TBST，洗3次，每次5min。二抗没问题。
  3.背景降下来后，可能目的条带就出来了，如果没有，那就得考虑蛋白提取的问题了，可能你提的时候就降解了。

• nn255 (2014-3-03 10:15:51)

  可能SANTA的一抗质量不好吧
  我手上在用的两个SANTA一抗背景都很高
  是不是提高下一抗稀释倍数试试
  还有是不是可以试下ECL显色啊,据说比DAB灵敏度高很多,也许会出条带呢

• yjf1026 (2014-3-03 10:16:11)

  
  有可能你的组织中这两种蛋白表达量较低，建议问Santa公司要这个蛋白的阳性对照试试看！

• yhz1973 (2014-3-03 10:16:28)

  
  湿转我做过，既然考染几乎无蛋白应该还可以，做个内参看一看，检测一下是否是你的操作步骤方面的原因。

• wmp1234 (2014-3-03 10:16:45)

  我也是，自己不会做，委托人，想当然的去弄，结果时好时坏，走了弯路！过年都不得安宁！

• greenbee (2014-3-03 10:17:03)

  
  先跑一次actin，看看条件是否成熟
  背景高可能是洗膜不够
  再就是santa的一抗可能不好

• ladyhuahua (2014-3-03 10:17:22)

  
  1. 羊抗本底很高，能够做出理想结果很不容易；
  2.建议降低一抗浓度到1:1000-1500；
  3.标本蛋白是否保存正确，蛋白是否损失；

• kuaizige (2014-3-03 10:17:41)

  
  转膜你如果用100ma就延长到4小时以上，我的经验是电流×时间最好大于400-500，肯定没有问题。

• vcve (2014-3-03 10:18:16)

  不知道你的样本是什么？有时候其他蛋白（如血红蛋白）会干扰太大，转膜后效果很差，建议蛋白变性时，适当调整缓冲液，可加入适量如β-巯基乙醇等。
  蛋白定量没问题的话，建议先做一下内参beta-actin或GAPDH，如果内参没问题，考虑目的蛋白含量、抗体质量以及具体实验操作了。我也建议采用ECL显色，适当提高一抗浓度，一般二抗不会有什么问题。并且可以延长曝光时间。
  以上是本人一些经验，不当之处请高手指正。

• 2541 (2014-3-03 10:18:37)

  
  你有阳性对照吗？我觉得最有可能是一抗不好，STANTA的抗体质量让人很是怀疑。原来做的MAPK signal pathway 很不好，但转用cell signal公司的结果perfect.所以有条件可以再买些其它公司的抗体试。western 的条件不会产生多大差别。

• yonger (2014-3-03 10:18:54)

  
  我个人认为一抗和二抗要用一个公司的比较好。
  我也用cell signaling公司的，条带出来的挺干净，后来二抗用完了，就用别的公司的二抗，出来了很多背景。
  另外你可以加长封闭时间试一试

• youyou99 (2014-3-03 10:19:19)

  
  影响WB的环节和因素太多，你说的太笼统的！建议从样品制备开始查明原因。背景高也有很多原因，你可以考虑延长封闭时间，以我的经验看santa羊多抗最好是4度过夜，而且要摇，有的时候我都封闭1天。要是还不行的话，就换BSA看看，正常兔血清也可以试试。另外，中杉的二抗本来就用甘油稀释了一倍，所以推荐量为1：5000时，在使用的时候只能按1：2500稀释，是不是再提高二抗的浓度看看。还有你用DAB显色，你的DAB能用吗？这些你都应该注意！最好有阳性对照，做beta－acting或者GAPDH看看。

• greenbee (2014-3-03 10:19:59)

  western blot都做了两个月了，还没结果，急啊。现在把我用的东西和条件给大家说说。盼各高手拔刀相助，先谢过了。
  1.检测的蛋白是大鼠的MMP-9（92kd）和Cox-2（80kd）
  2.8%的胶80v电泳，根据marker判断电泳时间
  3.100mA湿转2小时15分左右（考染几乎无蛋白）
  4.TBST洗膜，5%脱脂奶粉封闭37度1小时
  5.一抗是Santa Cruz的Goat多抗，封闭液1：500稀释，4度过夜
  6.二抗是中杉的HRP标记兔抗羊IgG，封闭液1：5000稀释，37度1小时
  7.DAB显色
  结果是背景高，没有条带。请帮忙分析一下，上面的步骤有什么不对的，特别需要注意的地方是什么。再次感谢。
  ......
  
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  重点建议：
  3.100mA湿转2小时15分左右（考染几乎无蛋白）
  建议，先做SDS-PAGE，考染看下结果
  6.二抗是中杉的HRP标记兔抗羊IgG，封闭液1：5000稀释，37度1小时
  中杉的二抗一般是加甘油稀释一倍的，建议1：2000稀释
  .DAB显色
  建议ECL显色
  请重新做一遍，反馈下结果，还有进一步的 建议，祝实验顺利

• 8princess8 (2014-3-03 10:20:39)

  
  我不明白啊,请问,为什么背景高还要增加2抗浓度呢?

• mysmdbl (2014-3-03 10:21:05)

  去上了一段时间的临床，很感谢大家的建议。我又准备开始做了，有什么问题还继续请教大家。

• tangxin_80 (2014-3-03 10:21:26)

  
  增加二抗浓度是解决目前没有条带的主要问题吧，等条带出来了如果背景高再慢慢调整封闭液浓度、时间以及二抗浓度，力求完美啦

• bananapeople (2014-3-03 10:23:11)

  我遇到了和unheyun一样的问题，不同的是我是采用阳性血清做的一抗，1：100和1：50 均没结果，希望有答