【求助】尿素融解包涵体的问题

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• 逗号是句号 (2014-3-03 10:29:16)

  
  我觉得是你的蛋白没有变性好才会出现这种情况，更换一下你的变性液，或者改变变性条件试试，我之前也遇到过类似的情况，你可以试着用盐酸胍变性看看。

• u234 (2014-3-03 10:29:34)

  
  我以前也遇到过这种情况,也跑过电泳.出现这种现象,就是破菌不完全造成的.
  破菌不完全不只是指菌体没有破开,还包括菌体虽然已经破开,但是核酸还不够破碎,即形成的核酸片段较大.
  你所说的这种情况属于后者,造成过大的核酸片段和蛋白结合,同时8M尿素溶解时会造成出现粘粘的感觉.因此,建议LZ:
  1.破菌前先在-20度将菌体冻实,然后再融开破菌.
  2.破菌液中加0.1mg/ml的溶菌酶,37度搅半至粘稠,然后粘稠的破菌液变的较稀时再超声,可适当加大超声的功率60HZ应该足够了.
  3.超声后,镜检,确保菌体破菌率95%以上.
  4.菌体大部分破裂后,加10微克/毫升的DAN酶1,搅拌45分,使大的核酸片段断裂成小片段,然后再离心

• @STAR@ (2014-3-03 10:29:57)

  谢谢楼上两位的帮助，等我买了试剂做了看看。呵呵。
  我的菌诱导过后离心原本就是在-20度保存的。溶菌酶我也加了，这个步骤是跟分子克隆上是一样的。DNA酶我倒是没加，因为看到有人说可加可不加，我当时觉得没什么所谓，也就没有买了。
  另外我也想用下盐酸胍，是说变性能力优于尿素。就是不太清楚这样得到的蛋白能否直接跟佐剂混合来免疫实验动物。
  谢谢帮忙。

• @STAR@ (2014-3-03 10:32:40)

  
  试了下，还是会有透明的不融物。用了盐酸胍，也用了DNA酶I。透明的东西还是在最后融解的时候才出来的。无论是尿素还是盐酸胍，接触了沉淀之后，在与液体的接触面上就会出现不融解的东西。

• wood533 (2014-3-03 10:33:08)

  
  本人也遇到了同样的问题,目前还未解决.准备用盐酸胍,不知你用的盐酸胍是多大浓度,6M是不是还不够?

• kuohao17 (2014-3-03 10:33:41)

  
  "用尿素融解包涵体之后，会发现离心管里有透明的黏糊糊的东西"
  这个很可能是核酸，所以加点dna酶试试看

• zranqi_1 (2014-3-03 10:33:58)

  我觉得可以加DNA酶，加的量可以适当提高些；也可以在去超声，将核酸链打断。变性的蛋白可以直接免疫动物。

• bs4665 (2014-3-03 10:34:40)

  
  其实溶解包涵体的过程是有讲究的，包涵体先用不含尿素的缓冲液超声悬浮，再按终体积加入相应的尿素粉末，这样就不会出现你们所说的透明块状物了，试试吧！

• @STAR@ (2014-3-03 10:39:29)

  我先多做点菌，过两天再试试。我之前洗涤的缓冲液里是不加尿素的，有一个洗涤缓冲液里加的是2M尿素，就我的效果来看，发现还是有不少蛋白在这个浓度给融解了，所以我就将2M的稀释到了0.5M的，最后用的是8M尿素，还有一个用的是6M盐酸胍。这次我再多加点DNase I吧。
  另外楼上说可以再去超声，我也做过，超声之后，我的蛋白很杂。谢谢大家的帮助。我尽快做。

• 逗号是句号 (2014-3-03 10:39:54)

  我想你可能误解我的意思了。我前面说的并非告诉你该怎么洗涤包涵体，而是洗涤之后的溶解过程。洗涤之后的包涵体沉淀最好不要直接加8M尿素溶解，那样很容易在包涵体表面形成你说的那种透明不溶物，告诉你，那不是什么核酸，而是蛋白。

• zsxan1990 (2014-3-03 10:40:15)

  注意DNA酶和溶菌酶的最适pH值是不同的，前者可能是7左右，而后者是8.5左右。

• @STAR@ (2014-3-03 10:40:43)

  恩，我确实是误解你的意思了，呵呵。确实没用过尿素粉末来融解包涵体。不过不太明白，是加入缓冲液后，然后再一点点加尿素粉末么，在加入缓冲液之后是不是要超声一下。。。
  也谢谢楼上的提醒，我真的是很懒得调pH，呵呵。

• yjf1026 (2014-3-03 10:41:05)

  楼上的话很正确 ，做实验PH 值很重要的。尤其实在做包涵体蛋白提取复性的时候，你的问题我上学的时候也遇到过，你如果有兴趣可以按照我的方法试一下，虽然有可能不对，但是我一直都是这么做的，并且结果都很好，因为这是我自己设计出来的。对于不对，大家交流吧。具体的我也忘了，大概步骤是：你先离心取得菌体，之后用高压过的蒸馏水稀释菌体，放在-70反复冻融，所谓融是放在冰水里融 ，融的时候要定时反复吹打，几次之后镜检。应该就完全破碎了。也可用超声波。之后加入DNA酶，具体浓度能查到，放置直到液体流动没有粘稠感为止，之后冷冻离心，离心之后要确保沉淀上没有粘稠的白色胶体，取沉淀，用6摩盐酸瓜溶解或8摩尿素溶解。溶解液里面好像还有什么盐类，我也记不清了。之后再透析浓缩，上动物。
  只是大概，对错与否请大家再补充交流吧，毕业好长时间，知识基本都还给学校了。

• wu11998866 (2014-3-03 10:41:27)

  我第一次做包涵体溶解时也遇到这种情况，哪些不溶物确实都是蛋白；我改进的方法是变性前先用含1%triton的缓冲液悬浮包涵体半小时，再洗涤两次，加入8M尿素变性，包涵体虽然没有马上全部溶解，但不溶物的比例很小了。

• vvmmoy (2014-3-03 10:41:47)

  
  菌离心后用1XPBS悬起来，加少量的DTT或是巯基乙醇，超声破破菌，离心。
  包涵体再用1XPBS悬起来，再加少量的固体尿素，一般终浓度为2M-4M， 再破一次，再离心。少量的尿素不会影响动物，盐酸胍会把动物搞死的

• taoshengyijiu (2014-3-03 10:42:04)

  
  建议你用7M的盐酸胍来裂解，PH2.5 2M的盐酸胍-TRIS缓冲液来复性，再透析去除盐酸胍即可进行后处理了。
  祝早日成功！

• @STAR@ (2014-3-03 10:42:20)

  
  谢谢帮忙，明天开工，少量少量的来，多做尝试。谢谢大家的帮助。

• @STAR@ (2014-3-03 10:42:43)

  
  昨天做了纯化，今天才跑的电泳。开始的时候从-20的冰箱取出的，加了1*PBS 10ml，然后吸打了一下，放到-70冻了起来，然后在冰上溶解。结果用了好长的时间。。。。所以我就没有反复冻融了。。。然后拿去超声了。超了一个小时。然后加了点DNase I，静置了大概45分钟。然后就离心了。然后就洗涤，破碎，再洗涤。。。最后发现加尿素溶液也好，还是加尿素粉末也好，都没有出现透明的不溶的东西。觉得可能还是我的菌体碎片之前没有除去干净，所以在蛋白表面会有透明不融的东西。又或者还有一个可能，就是这次加的溶液是按照包涵体沉淀的重量来加的，以前可能加的溶液少了。我就没有再尝试了。不过这次觉得沉淀比以前松散了许多。
  不过很郁闷的是，电泳了之后却发现原来65kd左右的蛋白似乎被超声成了2段。。。哎。。。我就是为了尝试一下，只希望不要有不融物就OK，结果PMSF,DTT或者巯基乙醇都没有加。。。
  谢谢大家，祝各位试验顺利。