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【求助】小牛血清封闭背景高怎么办？

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-3-03 11:01    作者: 8s5g    来源: 分析测试百科网

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【求助】小牛血清封闭背景高怎么办？

我做western blot,大鼠脑组织的。以前都用牛奶封闭，用TBST洗，背景很干净。这次用2.5%的小牛血清封闭抗原，还用TBST洗，但最后出来的背景很高，是怎么回事？是不是要换PBST洗？
另外，用小牛血清封闭一般浓度是多少？配置一抗、二抗时，一般用要百分之多少的小牛血清？
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最新回复

  • ritou1985 (2014-3-03 11:01:32)

    个人感觉BSA封闭效果很差，一般做都是用牛奶封闭，你为什么换为BSA封闭呢？还是用牛奶封闭吧，要不你就换为Sigma的小牛血清。

  • 8s5g (2014-3-03 11:01:49)

    我要做磷酸化的Akt，都说必须用BSA封闭，怎么办呢？

  • tuuu2 (2014-3-03 11:02:12)


    漂洗不足会导致过高背景，而过度漂洗则会洗脱抗体而使信号降低。推荐至少漂洗3次，每次5m.
    向TBS中加入最高0.5M NaCL和最高0.2％SDS并延长漂洗时间到2h可降低较顽固的背景。
    另外，适当降低二抗的浓度可将整体的高背景降低！

  • 8s5g (2014-3-03 11:02:30)

    谢谢！我以前用牛奶封闭时，用TBST洗3次，每次10min，效果很好的

  • junhun (2014-3-03 11:02:46)


    加大BSA浓度，一般我做的时候用10%，PBST洗3次，每次10分钟，效果还行

  • DNA (2014-3-03 11:03:10)


    BSA是牛血清白蛋白，和小牛血清是不一样的。我认为不能用小牛血清封闭，因为含血清有Ig，会和二抗有交叉反应的，当然会高背景。如果是专业的脱脂奶粉，去除了磷酸酶的，是可以用于磷酸化蛋白的。

  • 8s5g (2014-3-03 11:03:34)


    谢谢！哪里可以买到去除了磷酸酶的脱脂奶粉？用普通的奶粉做，往里面加磷酸酶抑制剂行不行呢？

  • duoduo (2014-3-03 11:03:56)


    对于磷酸化蛋白，要求用BSA,而不能用脱脂奶粉, BSA浓度为 5%, 封闭和一抗,二抗均用该浓度, 背景如高,增加TTBS洗膜次数, 一般洗4次, 前三次每次5min, 最后一次10min, 一抗稀释按照 抗体试剂说明书, 二抗稀释 可用1:10000,
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