月度关注热点

【求助】P-P38做不好

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-3-03 14:47 作者: Ao7 来源: 分析测试百科网

做P-P38有一段时间了，买的抗体是santa cruze的一组装----小鼠抗大鼠一抗（IgM）,二抗是羊抗小鼠，都用1：500（推荐1：200--1:1000）,曾出来过，但是最近就不行了……抗体都快用完了，样本还有一半没做出来
那位做过该抗体，或者使用过这种一组抗体的，说说经验
先谢过了

查看完整版本请点击这里：
【求助】P-P38做不好

我也来说两句查看全部回复

最新回复

redbutterfly (2014-3-03 14:48:15)

为什么要买鼠抗呢？同一种属的抗原识别并不好，我原来做免疫组织化学的时候，老师说过的。建议用兔抗或羊抗（一抗）。
这个抗体没做过，打算做。请有经验的战友提供经验。
Ao7 (2014-3-03 14:48:42)

做的另外的几个抗体都还可以阿，也是鼠抗
49888 (2014-3-03 14:54:13)

我也在做，二抗是自带的IGM，还在摸条件，怎么也做不出来，货号是SC-7973!不知和您的是否一样！请指教
PINK (2014-3-03 14:54:36)

请问楼上几位做过的，能不能分享一下细胞裂解液的配方，还有就是蛋白提出后需不需要变性。
是用同一种配方提总蛋白，然后用非磷酸化和磷酸化的一抗分别孵育，还是用提总的和提磷酸化的细胞裂解液两种呢
u76mp (2014-3-03 14:55:50)

我买的是cell-signaling technology的p-p38，兔抗，一抗1000倍稀释，室温1hr，2抗HRP标记的抗兔，45min。结果挺好的。

81496914.jpg
66+77 (2014-3-03 14:56:08)

请问楼上的，你是用同一种配方提的总蛋白，然后用非磷酸化和磷酸化的一抗孵育的吗？蛋白提出来，要不要变性呢？
u76mp (2014-3-03 14:56:30)

QUOTE:
原帖由 66+77 于 2014-3-3 14:56 发表

请问楼上的，你是用同一种配方提的总蛋白，然后用非磷酸化和磷酸化的一抗孵育的吗？蛋白提出来，要不要变性呢？
不好意思，不是很明白，
1 你指的同一种配方是？
2 非磷酸化和磷酸化的一抗孵育？
3 提完蛋白，我是习惯95度变性2分钟，然后跑电胶。
u76mp (2014-3-03 14:57:01)

为什么要买鼠抗呢？同一种属的抗原识别并不好，我原来做免疫组织化学的时候，老师说过的。建议用兔抗或羊抗（一抗）。
这个抗体没做过，打算做。请有经验的战友提供经验。

=================

我用的是这个型号

51464344.snap.jpg
BOSS2011 (2014-3-03 14:57:18)

不好意思，我没说明白
１、提取磷酸化和总蛋白的是同一种细胞裂解液吗？
２、蛋白提完后变性会不会影响其活性呢？
u76mp (2014-3-03 14:57:53)

QUOTE:
原帖由 BOSS2011 于 2014-3-3 14:57 发表

不好意思，我没说明白
１、提取磷酸化和总蛋白的是同一种细胞裂解液吗？
２、蛋白提完后变性会不会影响其活性呢？
1. 我目前为止取的总蛋白和磷酸化都是用同一种细胞裂解液，又没有特例就不能100%保证。
2. 如果你是用来测活性，比如我上次测MMP的活性，用Gelatin zymography，那么就不能95度变性；如果你仅仅是看蛋白的表达量，那么变性也没有关系。一般跑western不是看活性，是看表达量。
看你想做什么了，根据你做什么才能决定方法。请参考。
BOSS2011 (2014-3-03 14:58:11)

再次请教楼上的，请问您的细胞裂解液配方是什么样的，需要加NAF或是NA3VO4这样的磷酸酶抑制剂，或是只加蛋白酶抑制剂就可以了，谢谢，极切盼望回答