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【求助】帮帮我吧

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-3-03 17:31    作者: tianmei001    来源: 分析测试百科网

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【求助】帮帮我吧

大家好，我在做western时遇到了一些问题，希望有人帮我：
我用立春红染色时出现很漂亮的带，这可以说明我转膜成功吧，可是在用阳性血清（1：100稀释）作为一抗，金杉的山羊抗人IgG（1：5000）做二抗，采用DAB显色时却未出现，请问大家谁能帮我分析一下，谢谢！
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最新回复

  • DONT (2014-3-03 17:32:47)


    按你的描述，可能的原因太多了。
    抗体稀释度、孵育时间，显色液配置、作用时间，等等

  • tianmei001 (2014-3-03 17:33:38)


    我今天又做了一次，血清1：50稀释，常温（28度左右）2小时，二抗1：5000稀释，37度孵育1小时，显色液(DAB6mg,Tris PH7.6 9mL,0.3%氯化镍1mL)是现用现加过氧化氢，显色液也是当天配当天用，是在不知道问题出在哪？请大家帮帮我。

  • duoduo (2014-3-03 17:35:10)

    SDS-PAG后，蛋白 变性了，而你的阳性血清是具有一定的高级结构的，也就是你的阳性血清有可能不识别简单的一级结构。
    建议 用蛋白包被，做ELISA 检测一下。

  • tianmei001 (2014-3-03 17:36:01)

    我做的是动物的病原的GST重组抗原，用人的阳性血清来做的western不出结果能不能与这有关系？

  • tianmei001 (2014-3-03 17:38:26)


    SDS-PAG后，蛋白 变性了，而你的阳性血清是具有一定的高级结构的，也就是你的阳性血清有可能不识别简单的一级结构。
    建议 用蛋白包被，做ELISA 检测一下。
    如果ELISA出了结果，我要western的图怎么办

  • 831226 (2014-3-03 17:38:55)


    加大抗体浓度哦，我碰见过只能直接用血清孵育才能出结果的情况。1：50都做不出来。而且还是HRP标记的二抗，比你的DAB应该敏感很多吧。很奇怪的是作WB为什么要dab标记的二抗？虽然也有棕色的影子，不过很少人这么做吧？也许是我少见多怪了。

  • 12xunmei (2014-3-03 17:39:39)


    用ECL吧，我用DAB怎么做都做不出来

  • tianmei001 (2014-3-03 17:40:11)


    谢谢大家，我今天有重做了一次，加大了抗原的浓度，不知道能否做的出来
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