【求助】微生物蛋白的提取纯化

最新回复

• 阿司匹林 (2014-3-07 09:57:21)

  
  是要提取总蛋白？还是某一种蛋白啊

• lxh031 (2014-3-07 10:32:42)

  
  硫酸铵沉淀后会有很多盐，你直接上离子交换柱吗？那样会影响纯化效果吧。

• vcve (2014-3-07 10:33:24)

  
  感谢上面两位的回复。我要提取的是脂环酸芽孢杆菌中特定的一种蛋白，是由十二个亚基组成，每个亚基的分子量是20kD。在硫酸铵沉淀后，我是经过透析过膜然后才上离子交换柱

• DONT (2014-3-07 10:34:13)

  
  要从复杂背景中提纯单一蛋白的确很难，楼主不要急，急也急不来的。
  两个柱子远远不够，三类柱子 （离子交换，疏水，凝胶）恐怕都得用上，每一类柱子也许要不止一种填料。
  另外，为什么不把基因克隆到 E. coli 中表达呢？耐热耐酸，就凭这两点，可以用高温和低pH处理去掉很大一部分宿主蛋白，简化纯化工作，而且重组表达又高效，简单，你还可以加上纯化标签，比如 His-Tag，GST 等等。

• vcve (2014-3-07 10:34:47)

  我最近也在考虑是否可以把基因克隆到 E. coli 中表达，文献中也有人是采用基因表达的方法做的，但是我不大懂关于这方面的知识，请问一下如果采用这种方法大概需要多长时间？并且怎样才能得到想提取的Dps蛋白的基因？盼望您的回复

• tuuu2 (2014-3-07 10:35:23)

  
  通过您对这种蛋白质的描述，我向您是在提取一种酶或抗性蛋白，蛋白分子量较大，亚基较多，应属不易纯化的蛋白质。在明确知道蛋白质等电点的情况下，巧用各种离子交换层析，纯度一般都能达到90%以上的。结合其他的纯化方法，应该能够达到你想达到的要求。

• 30moonriver (2014-3-07 10:35:47)

  
  如果这个菌的基因组序列已知的话，就没有必要从发酵液或胞内裂解液中进行纯化，直接克隆表达就可以了，通过his-tag纯化，这样会快很多，如果顺利的话这会去除很多的杂蛋白，在结合离子交换、分子筛会得到你想要的蛋白质。

• vcve (2014-3-07 10:36:09)

  我现在的问题是不知道这个菌的基因组序列，一直没确定是否需要引入基因的方法。如果采用基因的方法，不知道这个菌的基因组序列，是不是就无法进行克隆表达啊？如果不采用基因的方法，不断的富集微生物通过增多原料的量不知是否会得到想要的蛋白？