【求助】酶的硫酸铵沉淀回收率奇低？

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-3-08 14:08 作者: mod=8048 来源: 分析测试百科网

最近的实验中出了很多问题，我的发酵液的酶活力比较高的时候开始做硫酸铵沉淀，结果每次的回收率都不到１０％，我看到大部分的文献结果中硫酸铵沉淀都可以达到６０％－８０％的回收率．
我尝试过分极沉淀，每一步的沉淀都会有很高的损失，发酵液上清４度放置２４小时，酶活力变为８０％．做硫酸铵沉淀时我选用的是８０％的饱和度．试过用氨水调ＰＨ结果差不多，都很低．
这是什么原因啊？？愁死我了

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喵咪 (2014-3-08 14:32:38)

你的回收率指蛋白量还是活性？这是不同的问题，有些蛋白沉淀了，活性就丧失了，无法复性回来。
lixi559 (2014-3-08 14:33:01)

如果你的样品比较多的话，建议你取小样，用不同浓度的硫酸铵沉淀沉淀看看，沉淀后半小时检测上清和沉淀的酶活，挑个合适的放大做。
mod=8048 (2014-3-08 14:39:39)

酶活力的回收
不同的浓度做过梯度但是都会有很大的损失
duoduo (2014-3-08 14:53:48)

对于酶的纯化没做过，但是感觉你可以在缓冲液中添加一些保护剂，例如巯基乙醇，DTT，或者其他的什么。
flower-201 (2014-3-08 14:54:06)

你硫酸铵沉淀的条件是什么？？
喵咪 (2014-3-08 14:54:23)

可能你的酶不适合用硫酸铵沉淀（或者沉淀后酶恢复活性不容易，可以试透析的方法去盐。看看效果如何）
可以采用直接柱层析纯化的方法。
DONT (2014-3-08 14:54:43)

如果直接过柱的话对于发酵液来说是不是工作量太大了？
可否试试用别的沉淀方法，如酒精沉淀什么的
喵咪 (2014-3-08 14:55:06)

沉淀意味着结构的改变，直接的后果是对能否恢复正确结构、活性有担心。沉淀的机理都是暴露疏水基团。
发酵液直接过柱是工业生产标准过程。
ending (2014-3-08 14:55:26)

嗯，浓缩还是过柱好一点，用离子交换或者亲和层析都可以。
不过硫胺沉淀对酶活的影响应该不大的，建议你调整缓冲液成分。